真核生物的基因组DNA包裹在染色质中，因此真核DNA复制发生在染色质环境下。染色质的基本结构单位是核小体，由147 bp DNA缠绕的组蛋白八聚体组成，组蛋白多种翻译后修饰是表观遗传信息的承载基础。DNA复制时染色质打开然后重新建立，使得DNA复制和染色质复制的偶联，在此过程中亲本染色质携带的表观遗传信息被分配到新合成的子链DNA，因此染色质重建也是表观遗传信息继承的基础，维持基因组和表观基因组稳定。染色质重建的起始步骤是DNA复制偶联的核小体组装，同时也是表观遗传信息继承的关键一环，其核心是DNA合成和核小体组装的偶联。
碱基配对形成了双螺旋结构的DNA，两条链的互补性决定了DNA是以半保留的方式进行复制。组成DNA的两条链是反向平行的，因此解螺旋的DNA的两条单链具有方向，一条是5’-3’，另一条链是3’-5’，但是DNA聚合酶都是5’-3’方向进行合成的，导致复制叉上两条链的合成方向相反。由此DNA复制的一条链是向复制叉前进的方向连续合成，称之为前导链，而另一条链的合成方向和复制叉前进的方向相反，先合成小片段DNA然后连接成完整的DNA分子，这个机制是冈崎夫妇发现的，所以这些短片段称之为冈崎片段，这条链称之为滞后链。滞后链冈崎片段合成先是Pol α合成带有一段RNA的DNA引物，然后发生聚合酶Pol α到 Pol δ的转换，Pol δ继续合成冈崎片段。其间Pol δ通过链置换反应入侵前一个冈崎片段，将含有RNA的保真度较低引物置换，形成单链翘起，进而招募Fen1等核酸酶进行切除被置换的单链DNA，产生的缺口被DNA连接酶（酵母中是Cdc9）连接，保障冈崎片段成熟，形成完整连续的滞后链DNA。伴随冈崎片段合成，核小体也会迅速组装，以免DNA暴露。前期Whitehouse和Smith的研究表明，真核生物的冈崎片段大小与核小体DNA和连接DNA的长度相当，且连接位置在核小体近中轴区，提出滞后链上核小体可以阻碍Pol δ的行进决定冈崎片段的长度[1, 2]。由于没有直接证据，核小体组装和冈崎片段成熟过程的协同机制尚不明确，李晴课题组发展了电镜核酸技术，对此机制进行了解析。
Science Advances
2024年8月9日，北京大学生命科学学院、北大-清华生命科学联合中心李晴课题组在Science Advances发表题为“DNA polymerase δ subunit Pol32 binds histone H3-H4 and couples nucleosome assembly with Okazaki fragment processing”的研究论文，巧妙利用DNA连接酶降解体系，应用电镜核酸技术观察酵母细胞中DNA复制叉中间体结构，发现核小体中组蛋白和DNA的相互作用决定了链置换的位置，而且DNA聚合酶δ的Pol32亚基在C端有一个组蛋白H3-H4的结合区域，可以直接贡献于后随链上的核小体组装，揭示了后随链上DNA合成和核小体组装的协同机制。
研究者在芽殖酵母中利用AID（Auxin-induced degradation）系统诱导Cdc9在DNA复制早期快速降解，抑制冈崎片段末端的连接，进而在透射电镜下观察DNA复制中间体，发现在超过94%的复制叉上都含有翘起的DNA结构（flap structure），并且这个翘起结构主要集中在其中一条子链上，进一步的分析表明有翘起发生在滞后链(图1)。通过测量翘起结构 (Flap)的两个主要特征(图2)：Flap本身的长度和相邻Flap的间距，研究者发现，1)在野生型背景下，Flap的长度集中分布在52 nt左右，其长度受到Pol δ的链置换活性和Fen1的核酸酶活性调控，而且Flap的长度分布具有13-15 nt的步长，可能是由核小体中周期性组蛋白和DNA相互作用障碍链置换合成造成的。2）相邻Flap的间距与冈崎片段长度相似，集中在190 bp左右。该间距的增大来自于DNA复制偶联的核小体组装突变，例如经典组蛋白分子伴侣CAF-1大亚基Cac1的缺失突变（cac1Δ）以及Mcm2结合组蛋白突变mcm2-3A，两个突变分别会导致新合成组蛋白的组装缺陷和旧组蛋白回收缺陷，这个间距增加到280bp左右，表明冈崎片段的合成受核小体组装程度调节。
图1：电镜核酸技术观察DNA连接酶降解后的复制叉结构。
图示复制泡结构；左图是Cdc9降解后，右图是未降解对照。
研究者在Pol δ亚基非催化亚基Pol32缺失突变中观察到flap间距变大，和上述提到核小体组装突变cac1Δ以及mcm2-3A的间距变化类似 (图2)。研究者进一步通过体内、体外分析直接证明了Pol32的C端可以直接结合组蛋白H3-H4，并通过ReIN-Map方法证明Pol32调节滞后链上的核小体组装。
图2：翘起结构 (Flap)的两个特征：
Flap的长度 (A)和相邻Flap的间距(B)。
综上，李晴课题组应用电镜核酸技术直接观察复制叉滞后链的分子事件，发现Pol32介导了核小体组装，进而提供了冈崎片段合成过程中链置换的终止位置，为冈崎片段成熟和核小体组装协同机制提供直接证据(图3)。
图3：Pol32介导核小体组装与冈崎片段成熟协同机制。
(i) Pol δ催化冈崎片段合成；(ii) 冈崎片段合成后，通过Pol32快速组装H3-H4四聚体到新合成的DNA上；(iii) Pol δ侵入先前产生的具有新生核小体的冈崎片段；(iv) 冈崎片段合成的重复循环，形成反应核小体间距的flap间距；在Pol32缺失突变体中，核小体组装水平下降导致核小体屏障的减少，进而导致冈崎片段增长。
参考文献：
[1] D. J. Smith, I. Whitehouse, Intrinsic coupling of lagging-strand synthesis to chromatin assembly. Nature 483, 434-U480 (2012).
[2] N. C. Koussa, D. J. Smith, Post-replicative nick translation occurs on the lagging strand during prolonged depletion of DNA ligase I in. G3-Genes Genom Genet 11 (2021).
李晴：
北京大学生命科学学院教授、北京大学-清华大学生命科学联合中心研究员，博士生导师。
实验室研究领域：
表观遗传信息的继承是生命个体正常发育的基础，在生殖、发育和衰老等过程中发挥关键作用。该过程的失调与多种疾病相关，包括肿瘤、神经退行性病变和早衰等，因而对人类健康产生深远的影响。表观遗传信息的继承的核心阶段发生在细胞周期的S期中的DNA复制过程。伴随DNA复制，母链染色质需要解组装，而在子链上需要重建染色质，意味着母链表观遗传信息在子链间的分配和继承，子代细胞可弹性继承亲本细胞的可遗传的表观遗传信息。
本实验室长期致力于表观遗传信息继承（Epigenetic Inheritance）的分子机制。我们以芽殖酵母和胚胎干细胞为研究模式，运用经典的生物化学、遗传学等方法结合前沿的组学方法、荧光成像等技术，以染色质复制过程为切入点，揭示表观遗传信息继承的基本规律，解析其与基因组稳定性维持，细胞命运决定等的关联机理。主要研究内容包括：
1.染色质携带的表观遗传信息的继承和分配机制：重点关注“新、旧”组蛋白在DNA复制叉两条子链的传递机制，阐明该过程对异染色质的建立和维持的影响，探讨其在胚胎发育中的重要作用。
2.染色质组装机器(包括组蛋白分子伴侣、染色质重塑因子和染色质修饰酶等调节因子)和DNA复制机器（复制体）的“对话”机制：DNA复制和染色质复制偶联是生命科学的基础问题之一，这是维持基因组稳定和表观遗传组稳定的核心基础，因此我们长期关注这两个基本过程的偶联机制，重点关注染色质组装对DNA复制反馈的调节机制，以及此过程异常和人类疾病的关系。
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