②穿刺区域剪毛消毒；穿刺点位于寰椎横突和枕骨隆突形成的三角形中心处。
③用拇指和中指触诊寰椎横两翼，用食指触诊枕突，形成三角区。
④将脊髓穿刺针插入三角区的中心点。随着穿刺针的推进，当穿过寰枕背侧硬膜时会感觉到“嘭”的一声，然后当穿刺针进入蛛网膜下腔时会出现轻微的阻力消失（落空感）。但是对于小型犬和猫，这种“嘭”的感觉比较小。
⑤取出管芯针，观察是否有脑脊髓液流出。如果没有脊髓液流出，放回管芯针，每次进针1~2mm，每次检查脊髓液的流出量。（操作人员可通过按压阻断颈静脉来增强脊髓液的流量，但是如果患病动物有肿瘤或者其他占位性肿块时，颅内压增高会导致临床症状恶化）。
注意：如果连续尝试操作两次都没有成功，考虑腰椎穿刺取样或者24小时后再做尝试。因为每次获取脑脊髓液的尝试都会增加血液感染的风险。如果采集的样本做病理学检测，应告知病理学家脑脊液采集地点，因为蛋白质含量和细胞计数可能因采集地点而不同。
