论著 | aFGF修饰自体成纤维细胞治疗食管吻合口瘘的实验研究

目的

验证酸性成纤维细胞生长因子（aFGF）基因修饰的自体成纤维细胞（FB），联合纤维蛋白胶在促进食管吻合口瘘愈合过程中的作用，探究其作为治疗食管癌术后吻合口瘘新方法的可行性。

方法

通过兔颈段食管切开缝合置管法构建食管吻合口模型，同时获取皮肤组织，采用酶消化方法原代培养自体皮肤FB。采用aFGF过表达腺病毒转染FB，并通过蛋白免疫印迹和酶联免疫吸附实验检测修饰细胞中aFGF的表达和分泌情况。将20只实验兔随机分为aFGF修饰FB联合纤维蛋白胶治疗组（aFGF+FBs组）和单纯纤维蛋白胶治疗组（对照组）。通过大体标本和颈部食管增强计算机断层扫描（CT）观察吻合口瘘的愈合情况。采用感染率和生存曲线比较aFGF+FBs组和对照组的治疗效果。

结果

本实验成功构建了兔颈段食管吻合口瘘模型。修饰后的自体皮肤FB能够显著表达和分泌aFGF。与对照组相比，aFGF+FBs组的感染率低（20% vs. 70%），生存率获得了显著提升（P<0.05）。

结论

aFGF修饰的自体FB联合纤维蛋白胶能够显著降低食管吻合口瘘的感染率，促进瘘口愈合，降低死亡率。因此，本方法为防治食管吻合口瘘这一临床亟待解决的难题提供了有希望的替代方案。

食管吻合口瘘；自体成纤维细胞；碱性成纤维细胞生长因子

一、对象

采用6～10月龄、体重1～1.5 kg的普通级雄性新西兰大白兔（n＝20）进行实验，许可证号：SCXK（沪）2017-0004。饲养条件：饲料执行标准GB14924.3-2010《实验动物配合饲料营养成分》。饮用水为灭菌二级超纯水，饮用水质量符合中华人民共和国国家标准《生活饮用水卫生标准》（GB5749-2006）的规定。实验动物房使用许可证号为SYXK（浙）2020-0013：环境温度范围20～25 ℃，相对湿度范围40%～70%。试验前在动物房中适应环境1周。

二、方法

1．自体皮肤FB原代培养和鉴定：

无菌手术切取4～5 cm2治疗组兔的背部皮肤组织2块，在4 ℃杜氏改良Eagle培养基（Dulbecco’s Modified Eagle Medium，DMEM）培养基中去除脂肪、血管等，用无菌眼科剪将组织剪碎至长度约5 mm小块。0.25%胰酶预消化5 min后加入10%胎牛血清终止消化，磷酸盐缓冲生理盐水（phosphate buffered saline，PBS）反复清洗后将组织块置于2.5 mL分散酶Ⅱ溶液中4 ℃孵育过夜。随后，用无菌显微镊子小心地将真皮与表皮分开，再将真皮组织块置于Ⅰ型胶原酶溶液中，37 ℃，5%CO2条件下摇床孵育1 h后加入FB培养液终止消化。最后用培养液重悬离心沉淀的细胞，转移至培养瓶中。4 h后显微镜下观察可见细胞贴壁，细胞质恢复梭形，部分细胞仍未贴壁，更换培养液去除未贴壁杂细胞。继续培养细胞达到85%～90%汇合度时，按照1:3比例传代。光学显微镜下观察原代及传代后的细胞，拍照记录细胞形态特征。蛋白免疫印迹法和细胞免疫荧光法检测皮肤FB标志物波形蛋白的表达。

2．aFGF过表达腺病毒载体的转染：

aFGF重组腺病毒过表达载体获赠自海军军医大学附属长海医院胸心外科实验室。取对数生长期的细胞，用0.25%胰酶消化，显微镜下确认所有细胞刚好脱落，立即加入FB培养基终止消化，1 000 r/min离心5 min，计数后铺于6孔板内，每孔加入约5.0×104个细胞，放入培养箱中静置过夜。转染前更换培养液，按照感染复数（multiplicity of infection，MOI）值为100时的病毒量转染细胞。腺病毒感染24 h后换液，48 h后观察细胞荧光情况。分别采用蛋白免疫印迹法和酶联免疫吸附实验检测皮肤FB及培养液上清中aFGF的表达量。

3．食管吻合口瘘动物模型的构建：

将新西兰大白兔麻醉后仰卧位固定。游离颈段食管，切开食管全层，插入外径2.5 mm橡胶管后，用6-0聚丙烯缝线连续缝合食管，充分固定橡胶管。留置橡胶管7天，置管处即为吻合口瘘口。术后静脉应用广谱抗生素，通过留置橡胶管给予肠内营养（将饲料颗粒溶解于饮用中配置），避免经口进食。干预治疗后，经耳缘静脉输注5%葡萄糖溶液，48 h后恢复饮水，72 h后恢复经口进食。

4．食管吻合口瘘的治疗和效果评价：

数字表法将实验兔随机分为aFGF修饰FB联合纤维蛋白胶治疗组（aFGF+FBs组）和单纯采用纤维蛋白胶治疗组（对照组）。建模7天后，拔除留置橡胶管。采用0.1 mL、含有2×106个aFGF+FBs的纤维蛋白原与0.1 mL血凝酶配置成的治疗凝胶注射至瘘口处。对照组则仅使用同体积不含细胞的纤维蛋白胶注射。通过大体标本和颈部食管增强CT观察吻合口瘘的愈合情况。吻合口周围皮温升高，软组织红肿、渗出明显，表面见化脓性液体覆盖，为瘘口感染表现。采用感染率和生存曲线比较治疗组和对照组的临床效果。

三、统计学处理

所有的计量数据以均数±标准差表示，并使用GraphPad Prism 8进行统计分析。两组间独立样本采用Student t检验；多组间独立样本采用方差分析。P<0.05为差异具有统计学意义。

一、兔自体皮肤FB的分离培养和鉴定

采用胰酶消化法原代培养兔自体皮肤FB，显微镜下的形态学分析可见细胞呈细长梭形或多角形（图1A）。细胞活性良好，增殖速度快，3天即可传代1次，为满足后续治疗所需要的细胞量提供了保障。FB特异性表达波形蛋白（vimentin），因此采用细胞免疫荧光和蛋白质印迹法检测细胞中vimentin的表达和分布。蛋白免疫印迹结果提示细胞中vimentin显著表达（图1B）。细胞免疫荧光染色提示分离培养的细胞中vimentin（绿色荧光）表达丰富，而阴性对照组中基本观察不到荧光信号（图1C）。

二、修饰的自体皮肤FB能够有效表达和分泌aFGF

采用aFGF-GFP腺病毒转染自体皮肤FB后的GFP荧光标签情况如图2A所示，荧光率可达95%以上，提示aFGF-GFP腺病毒成功修饰兔自体FB。蛋白质印迹法结果提示，在aFGF腺病毒载体转染后，皮肤FB中aFGF的表达量随时间呈梯度上升（图2B）。进一步的酶联免疫吸附实验结果显示，转染修饰的细胞培养液中aFGF浓度也随着时间逐步增高，而对照组细胞培养液中的aFGF无明显变化（图2C）。

三、兔颈部食管吻合口瘘模型的构建

采用兔颈部食管切开置管法成功构建了颈部吻合口瘘模型。切开食管全层后，插入外径2.5 mm橡胶管，用6-0聚丙烯缝线连续缝合食管，充分固定橡胶管，置管处即为吻合口瘘口（图3A）。建模成功后，将aFGF修饰的自体FB混合纤维蛋白凝胶（aFGF+FBs组）注射于瘘口处（图3B），对照组单用纤维蛋白凝胶。凝胶在室温下快速凝结，附着于瘘口表面。

四、颈部食管瘘口治疗后的大体标本和影像学观察

大部分aFGF+FBs治疗组的瘘口完全闭塞（愈合率80%），黏膜和外膜均愈合（图4A）。相比之下，多数对照组的瘘口持续存在（愈合率30%），周围组织肿胀明显，且可见坏死组织（图4B）。颈段食管增强CT影像显示，对照组主气管与颈段食管间隙可见造影剂（图4C），提示食管瘘口持续存在。相比之下，aFGF+FBs治疗组的气管-食管间隙未见造影剂漏出（图4D），提示瘘口闭合良好。

五、aFGF修饰的FB联合纤维蛋白胶治疗食管吻合口瘘的临床指标观察

组织标本观察显示，aFGF+FBs组的感染率为20%，而对照组的感染率为70%（图5A），提示aFGF修饰的FB有助于控制瘘口感染。更为重要的是，aFGF+FBs治疗组的生存率也显著优于对照组（图5B）。aFGF+FBs治疗组1例因感染死亡，1例因血管破裂出血导致死亡。对照组中4例因化脓性感染死亡，1例因进食困难致恶病质状态。

食管吻合口瘘是食管癌患者食管切除重建术后最常见、也是预后最差的并发症之一。术后早期可引起纵隔炎或脓胸，延长住院时间。无论保守策略包括充分引流和感染控制，还是积极的手术修复治疗，其效果均不令人满意^[10,11]。

相比手术治疗，近年来，内镜植入物治疗食管吻合口瘘的方法取得了巨大进展，自膨胀金属支架（SEMS）和腔内真空治疗（E-Vac）越来越多的被应用于临床。SEMS是部分或完全覆盖的金属假体生物医学装置，可以在内窥镜下放置。其目的是在组织愈合时覆盖吻合口缺损，同时保留开放的管腔，可以有效引流并促进瘘口愈合。然而，使用该装置治疗近端（颈部）食管吻合口瘘时会因近端难以固定而导致较高的失败风险^[12]。且SEMS相关的并发症发生率为34%～78%，包括支架移位、食管穿孔和瘘管形成等^[13]。E-Vac是一种较新的内镜下治疗食管吻合口瘘的技术。该装置的远端为聚氨酯海绵，提供吸力并密封漏腔。尽管该技术已广泛应用于肠穿孔治疗，但其在食管吻合口瘘治疗中的应用直到2005年才开始，2010年报告了第一个临床试验结果。据报道，E-Vac治疗食管吻合口瘘闭合的临床成功率为67%～78%^[14]。但在其治疗过程中，需要每3～4天更换一次海绵内垫，这使治疗成本增高，且有食管狭窄、出血等并发症发生，具有一定局限性。

FB是一种广泛存在于结缔组织内的细胞，能够分泌胶原和其他ECM以维持结缔组织结构的完整性，在间质更新和创伤修复中发挥重要作用^[15]。新近研究发现，FB在血管新生过程中也扮演重要角色。受VEGF等多种生长因子的作用，血管内皮细胞增殖、迁移，最终分化形成新生血管网络。在此过程中，FB所起到的关键作用被越来越多的研究所揭示。FB可大量分泌VEGF、TGF-β和PDGF等血管新生所需的关键因子，促进内皮细胞的增殖、迁移^[16]。另有研究^[17]报道，FB的ECM合成功能在内皮细胞出芽和管腔形成过程中也起重要作用。将FB与血管内皮细胞共培养于纤维蛋白凝胶珠，培养4～5天内即可观察到内皮细胞出芽，且其中大部分可形成管腔样结构。而单种血管内皮细胞培养4～5天则大部分细胞死亡。此外，皮肤FB具有易获取（可经患者自体皮肤活检或手术切缘获取），易培养，可在体外大量扩增，且容易定植等特点^[18]。因此，本研究充分利用该细胞的这些优点，应用模型兔自体皮肤FB作为工具细胞治疗食管吻合口瘘。本研究切取足量的皮肤组织，采用酶消化法进行原代培养，使用胰酶消化法进行传代，从而保证在有限时间窗内获得充足的细胞。

从早期的表皮生长因子到后来的碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor, bFGF），临床使用显示出了这些细胞生长因子对于组织损伤具有修复作用。自1984年首次获得与bFGF高度同源的aFGF后，证实其具有促进损伤修复、促进血管生成、保护和营养神经元等作用。在创面酸性环境中，带负电荷的aFGF更容易与细胞膜上带正电荷的受体结合，发挥生物学效应，且aFGF的作用时间较bFGF更持久，对于创面修复治疗更加有利^[19]。尽管aFGF在促组织修复方面有很多优越性，但其在体内的含量甚微，且作为一种酸性蛋白质，其在体内的稳定性较差，生物半衰期短^[20]。当前，基因修饰所用的技术路线主要包括非病毒导入方法和病毒载体两大类。其中，化学法（钙磷酸盐转染）、物理法（电穿孔等）和脂质体等非病毒载体方案的转染效率仍旧较底。经FDA批准许可的病毒载体主要包括逆转录病毒、腺相关病毒和腺病毒。相较其他病毒载体而言，腺病毒载体的优点在于宿主范围广、理化性质稳定、遗传毒性低和感染率高，允许治疗基因达到短时间内的高水平表达^[21]。本研究充分利用上述优势，采用已经研究验证的稳定aFGF腺病毒过表达载体系统^[22]修饰细胞，将FB的外分泌功能与aFGF的生物学特性有机结合，提高aFGF在吻合口瘘组织区域的含量和稳定性。

纤维蛋白胶中含有纤维蛋白和凝血酶等成分，具有良好的生物相容性、生物可降解性和易操作可注射性等特点^[23]。纤维蛋白胶可在瘘口处快速形成纤维蛋白网，不但能够近期封堵瘘口，还可作为FB的输送载体，利于FB的黏附和增殖，其3D结构也利于后期的组织修复，形成新的毛细血管和肉芽组织，促进组织愈合^[24]。在本研究中，在纤维蛋白凝胶的3D支持下，自体FB或可通过减弱炎症反应、分泌ECM成分封闭瘘口等途径来促进吻合口瘘的愈合。

本部分研究成功构建了兔吻合口瘘模型，并通过表达腺病毒载体转染的方式构建了aFGF修饰的兔自体FB。应用该模型，我们通过影像学、组织病理学和临床指标全面评估了aFGF修饰的自体FB联合纤维蛋白胶对食管吻合口瘘的治疗效果。结果发现aFGF修饰的自体FB联合纤维蛋白胶能够显著降低食管吻合口瘘的感染率，促进瘘口愈合，降低死亡率。

在临床应用方面，本研究结果为aFGF修饰的自体FB联合纤维蛋白胶治疗食管吻合口瘘提供了初步的概念验证。FB混合纤维凝胶的自体移植或可与食管切除术同步使用，或在术后发现吻合口瘘时注射到瘘口位置，以到达预防吻合口瘘发生或快速封闭瘘口并促进其愈合之目的，从而改善食管癌的手术结局。此外，所提出的方法也可推广用于闭合、修复各种渗漏和瘘管，例如气管食管瘘、肠瘘，甚至用于内镜下切开自然腔道完成手术后的切口封闭。值得一提的是，内镜下注射自体细胞联合蛋白胶封闭瘘口的可行性和有效性已在我们近期发表的大动物研究中得到了验证^[25]。因此，本方法为防治食管吻合口瘘这一临床亟待解决的难题提供了有希望的替代方案。

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