ENVIRON EXP BOT：解析牧豆树胁迫耐受机制，培育逆境韧性作物

高温是主要的非生物胁迫因素之一，它还会引发其他胁迫，如干旱。地球温度自1880年以来每十年上升一定幅度，到2100年预计平均温度还会大幅上升，这将对农业产生严重影响，威胁粮食安全。植物的耐热性依赖于热休克蛋白（HSPs）和热休克因子（HSFs）。HSFs 通过与 HSP 基因上游的热休克元件（HSEs）结合来调控基因表达。当植物暴露在高温下时，HSFs 和 HSEs 被激活，促使大量 HSPs 的合成，这些 HSPs 能够修复和重折叠受损蛋白质，对植物的蛋白质内稳态和耐热性起关键作用。基因表达对植物生长、发育和适应环境至关重要，其受多种调控元件影响。启动子和终止子是植物中基因表达的两个关键调控元件。植物启动子是包含 RNA 聚合酶和转录因子结合位点的 DNA 片段，可分为组成型启动子和诱导型启动子。组成型启动子持续刺激下游基因转录，但缺乏特异性和对蛋白质表达的严格控制；诱导型启动子则能在特定刺激下以时空特异性的方式调控基因表达，在农业转基因应用中具有重要价值。终止子在基因表达中也起着重要作用，它决定了 mRNA 转录的量和稳定性。虽然在转基因植物开发中往往强调启动子的强度，但近年来终止子在调控基因表达方面的重要性也逐渐受到关注。终止子位于编码序列下游，其作用包括防止相邻基因的非预期转录以及增强 mRNA 转录本的稳定性。

牧豆树（Prosopis cineraria）是沙漠生态系统中的优势豆科树种，对高温、干旱等非生物胁迫具有高度耐受性，是研究植物抗逆性的良好材料。2024年10月9日，Environmental and Experimental Botany在线发表了阿联酋大学Sasi S等题为Learning from the desert legume tree, Prosopis cineraria to develop stress-tolerant crops的研究文章。该研究通过对牧豆树热激蛋白基因 PcHsp18.2 的启动子和终止子进行分析和功能验证，探讨了其在提高作物抗逆性方面的应用潜力。

材料与方法

HSP18.2 启动子和终止子的克隆：研究牧豆树Hsp18.2（PcHsp18.2）的相对季节性表达，设计启动子和终止子（分别为pPcHSP18.2 和 tPchsp18.2）引物，进行 PCR 扩增，产物纯化后克隆到载体并测序。

序列分析：识别和分析启动子和终止子序列中的顺式调控元件和调控基序，并与其他 HSP 启动子进行比较。

转化载体的构建：将 pPcHSP18.2（715bp）、ptPcHSP18.2（249bp）和 pCaMV35S（346bp）启动子克隆到植物转化质粒载体 pCAMBIA 1391Z 中 gusA 报告基因的上游。通过限制酶EcoRI和AvrII从pMiniT™ 2.0载体上切下启动子片段，与用相同酶切的pCAMBIA 1391Z载体的gusA基因上游融合，构建重组质粒：

pCAMBIA1391Z-pPcHSP18.2::gusA-tnos（命名为PGN）、

pCAMBIA1391Z-ptPcHSP18.2::gusA-tnos（命名为PTGN）、

 pCAMBIA1391Z-CaMV35S::gusA-tnos（命名为35SGN）。

将载体的tnos终止子替换为tPchsp18.2片段（249bp），通过合成包含从BstEII 到SphI的序列（保留tnos上游和下游到SphI 的序列），并将tPchsp18.2以正向、反向（tPchsp18.2 R）以及截短形式（tPchsp18.2₁₀₀）分别克隆到载体中，构建重组质粒：

pCAMBIA1391Z-pPcHSP18.2::gusAtPchsp18.2（命名为PGHT）、

pCAMBIA1391Z-pPcHSP18.2::gusA-tPchsp18.2₁₀₀（命名为PGHT₁₀₀）

pCAMBIA1391Z-pPcHSP18.2::gusA- tPchsp18.2 R（命名为PGHTR）。

农杆菌介导的烟草转化：采用 Kodackattumannil 等人描述的农杆菌介导转化方法，用重组质粒转化烟草（Nicotiana tabacum cv. SR1）叶片外植体。经过共培养、筛选和生根培养，获得转基因烟草植株。

转基因植物的确认：将具有健壮根系的单个假定转基因植株（用不同构建体转化）移植到装有盆栽土的盆中，在25°C、16h/8h 光照/黑暗光周期的植物生长室中生长。采用前述的 CTAB 方法从转化和未转化（野生型，WT）植株的叶片中提取基因组 DNA，用 PCR 和 GUS 组织化学染色确认转基因植株。按照 Kodackattumannil 等人的方法完成 T₀植物的建立和转基因株系 T₃后代的产生，T₃后代用于胁迫实验。

热胁迫和其他非生物胁迫：对转基因株系的种子（T₃）进行消毒后，按照 Kodackattumannil 等人的方法在含潮霉素的培养基上萌发和生长，WT植株在无潮霉素的培养基上萌发和生长。对不同生长阶段（10、20、40 天和开花阶段）的健康植株进行热胁迫和其他非生物胁迫处理，分析组织中的 GUS 活性，提取 RNA 进行基因表达分析。

花粉活力和萌发研究：用Ampha Z32花粉活力分析仪（瑞士Amphasys AG）分析花粉活力，用花粉萌发培养基培养花粉，分析花粉萌发率。

热胁迫下的结实和萌发：对植株进行热胁迫处理，分析结实情况和种子萌发率。

RNA 提取和 gusA 基因表达分析：提取植物组织中的 RNA，反转录为 cDNA，用实时定量PCR 分析 gusA 基因的表达。

研究结果

PcHsp18.2 基因的相对表达量在2021年呈现出季节性差异，在夏季表达量显著升高，呈现出高倍数表达（图 2A ）。在 2021年各个月份采集的样本中，6 月采集的样本中 PcHsp18.2 基因的表达量最高。这是因为 2021 年 6 月是当年温度最高的月份，该基因的表达可能与温度升高的热胁迫环境有关（图 2B ）。

PcHsp18.2的多序列和系统发育分析

通过多序列和系统发育分析发现，PcHsp18.2 与绿豆（Vigna radiata var. radiata）表现出高度的相似性。这表明PcHsp18.2 可能与绿豆中的同源基因在进化上具有较近的亲缘关系，它们可能具有相似的功能和基因结构。相比之下，PcHsp18.2 与拟南芥（Arabidopsis thaliana）的序列相似性较低。这说明 PcHsp18.2 在进化过程中可能发生了一些独特的变化，导致其与拟南芥的同源基因在序列上产生了较大的差异，其功能和调控机制可能也存在一定的区别。

PcHSP18.2启动子序列中顺式元件的结构分析

pPcHSP18.2序列分析显示出多个与环境信号相关的转录因子结合位点，包括高温、低温、干旱、ABA、盐和 SA 响应元件，以及组织/器官特异性表达元件。

HSP18.2 启动子和终止子的比较分析

pPcHSP18.2与拟南芥的pAtHSP18.2 具有较高的一致性，但包含更多的顺式元件，且热休克元件的结构和分布存在差异。tPchsp18.2与拟南芥的tAthsp18.2具有较高的相似性，但在调控元件的位置上存在差异。

gusA 基因在非生物胁迫下的表达

在热胁迫下，PGHT组合在叶、茎和根的维管束中表达量最高，PGHTR组合表达量较低。

PGN和PGHT植物中 gusA 基因的时空表达

在不同发育阶段和组织中观察到 GUS 表达的时空分布，PGHT 植物在所有花器官中表达量较高。

图7 热胁迫后，在转PGN基因的烟草植株中，PcHSP启动子调控下 GUS 的时空表达情况。（A）10 天龄幼苗，（B）子叶，（C）40 天龄幼苗，（D）幼苗根系，（E）幼苗茎，（F）成熟茎，（G）叶柄，（H）花朵，（I）花瓣，（J）柱头，（K）花药，（L）花粉粒，以及（M）萌发的种子。

花粉活力和萌发研究

PGN和PGHT植物在热胁迫后的花粉活力和萌发率均高于野生型。PGN和PGHT植物在热胁迫下的结实率和种子萌发率均高于野生型。

qRT-PCR 分析

gusA 基因的表达在不同胁迫下呈现差异。在所有测试组织（如植物的叶、茎和根）中，热胁迫下 gusA 基因表达量最高，而冷胁迫下所有组织中的相对表达量最低。

本研究验证了 pPcHSP18.2 和tPchsp18.2 在烟草植物中的诱导性，为基础和应用研究提供了应激诱导型启动子。PcHsp18.2在夏季表达量最高，表明其存在强大的调控机制，可用于挖掘高效基因和启动子，赋予作物耐受性状。

霜降：人间至此秋色尽，草木摇落露为霜。