安全的耗散过剩激发能对于放氧光合生物的生存和生产力至关重要。这种耗散过程被称为非光化学淬灭(NPQ)，它涉及通过多种不同响应时间尺度的机制使单重态激发叶绿素(1 Chl*)去激发。最快的响应，发生在几秒到几分钟的时间尺度上，被称为能量依赖性淬灭(qE)，通常是NPQ响应中最大的组成部分。qE依赖于维管植物中存在一种名为PsbS的pH感应蛋白，以及一个酶驱动的循环，即三种类胡萝卜素—紫黄质(Violaxanthin,Vio)，花药黄质(Antheraxanthin, Ant)和玉米黄质(Zeaxanthin, Zea)—根据光照条件进行相互转换。在强光下，紫黄质脱环氧化酶(VDE)通过花药黄质将紫黄质转化为玉米黄质(VAZ)。在弱光下，玉米黄质环氧化酶(ZEP)执行相反的反应(ZAV)。整个系统被称为叶黄素循环或VAZ循环。
尽管已经证明优化的光保护响应对于维持和提高作物产量至关重要，但qE和NPQ的一般分子机制仍然存在争议。例如，叶黄素(Lut)和玉米黄质(Zea)的重要性及其特定作用方式被广泛讨论。有些人认为Lut是通过激发态能量转移(EET)或电荷转移机制来淬灭1 Chl*。Lut还被证明可以淬灭三重态的叶绿素(3 Chl*)，这是一种由1 Chl*通过系统间交叉形成的强光敏剂。另一方面，也有研究在海洋微拟球藻(Nannochloropsis oceanica)中观察到Zea形成阳离子自由基(通过与叶绿素的电荷转移)和激发单重态(通过从叶绿素Qy状态的能量转移)，尽管这种生物缺乏PsbS，而是需要LHCX1来进行qE。海洋微拟球藻不含有Lut，这使得可以建立一个仅基于VAZ循环的定量模型。该该模型提出，pH传感器负责将色素-蛋白质复合物活化为活性淬灭形式。此外，Zea还被认为可能发挥变构作用，而不是明确的淬灭作用，通过帮助LHCII复合体的聚集，在这样的复合体中，荧光寿命是缩短的。
在光合作用激发能的传递研究中，可以通过使用瞬态吸收(TA)光谱学追踪叶绿素激发后的类胡萝卜素S1态的数量来探索类胡萝卜素(Car)在NPQ中通过Chl→Car进行激发能传递的作用。然而，由于叶绿素Qy(S1)到Sn的吸收光谱覆盖了大部分可见光谱，如果想检测如Car S1到Sn转换的额外贡献，需要良好信噪比的瞬态吸收光谱，特别是对于像类囊体膜这样高度散射的样品。这反过来需要比用于荧光寿命测量更高的激发脉冲能量。在所需的激发能量下，激发态-激发态湮灭(EEA)在类囊体膜这样的扩展激发态传输系统中几乎是不可避免的，这引起了人们的担忧，即在瞬态吸收测量中观察到的任何额外的瞬态物质可能仅仅是在湮灭过程中形成的高能物种的结果。
2024年10月8日，PNAS在线发表加州大学伯克利分校化学系Graham R. Fleming实验室和植物与微生物生物学系Krishna K. Niyogi实验室联合署名的，标题为Chlorophyll to zeaxanthin energy transfer in nonphotochemical quenching: An exciton annihilation-free transient absorption study的研究论文。在该研究中，Maly等人展示了一种非常简单直接的方法来分离非线性泵浦-探测信号的第三阶(单粒子)、第五阶(双粒子)、第七阶(三粒子)等的贡献。这种方法使得提取不受多粒子动力学如激发态能量转移影响的激发态动力学成为可能，并增加了我们对类囊体膜对高光照响应期间观察到的瞬态的信心。此外，瞬态吸收信号的第五阶贡献包含了关于激发态运动的信息，作者在这项工作中简要分析了这一点。
与本研究有关的早期研究是通过菠菜类囊体来做的，其中NPQ突变体不可用，未实现的研究目的在这项研究中通过本氏烟草(Nicotiana benthamiana)NPQ突变体的生成得到了解决。结合瞬态吸收数据和在关键突变体[缺乏PsbS的npq4、缺乏叶黄素的npq1和缺乏玉米黄质的lut2的本氏烟草]上收集的快照荧光寿命数据，强烈表明Chl Qy到Zea S1的激发态能量传递是强光条件下qE响应的一个重要组成部分。
实验材料：转基因本氏烟草(Nb-1)，10小时的日照时间生长。
基因编辑：使用CRISPR/Cas9技术在本氏烟中生成NPQ相关基因的突变体。
荧光表型：使用MAXI-Imaging-PAM(WALZ)脉冲振幅调制叶绿素荧光成像系统在室温下对植物进行全株和/或叶片打孔叶绿素荧光表型测量来鉴定目标直系同源物的CRISPR/Cas9 敲除。
瞬态吸收光谱学：采用泵浦-探测技术，通过隔离高阶非线性信号来研究激发态能量转移。
荧光寿命测量：使用时间相关单光子计数(TCSPC)技术测量叶绿素激发态寿命的变化。
色素分析：通过高效液相色谱(HPLC)分析叶片中的叶绿素和类胡萝卜素组成。
膜分离：通过超速离心法分离类囊体膜，并使用连续梯度蔗糖密度梯度离心法分析膜的组成。
在qE激活过程中，从激发态叶绿素Qy到玉米黄质S1的激发能量转移与叶黄素循环之间存在很强的相关性。在缺乏玉米黄质的npq1突变体系统中，没有叶黄素S1信号。此外，五阶响应分析显示，在强光照射下，激子扩散长度(LD)从62±6 nm减小到43±3 nm，这与激子运动范围缩小是植物对过量光照响应的一个关键因素是一致的。
图1 本氏烟草NPQ突变体的NPQ动力学和类囊体组成。展示了野生型和突变体在不同光强度下的NPQ响应，以及在高光处理前后的色素组成和类囊体复合体的分离情况。
图2 本氏烟草类囊体膜的快照叶绿素荧光寿命。展示了在高光-暗周期下，不同突变体的叶绿素激发态寿命变化和NPQ响应。
图3 本氏烟草类囊体膜的瞬态吸收动力学图谱和快照TA信号。展示了在高光和暗条件下，不同突变体的瞬态吸收信号变化。
图4 本氏烟草类囊体膜的PP3动力学图谱。展示了在高光和暗条件下野生型和突变体纯三阶非线性信号(PP3)动力学图谱，以及叶黄素S1态的演变。
图5 野生型类囊体膜的基态漂白动力学图谱。展示了在高光和暗条件下，纯三阶(PP3)和五阶(PP5)非线性信号的动力学图谱，以及通过PP5动力学分析激发态湮灭和扩散长度的变化。
非光化学淬灭(NPQ)减轻放氧光合作用固有的光氧化损伤。尽管长期以来人们都知道玉米黄质和叶黄素以某种方式参与淬灭激发的叶绿素。然而，这种光保护的生物物理机制仍然存在争议。使用基因编辑的本氏烟草NPQ 突变体和无湮灭瞬态吸收光谱，该研究直接观察到玉米黄质而不是叶黄素在激发能转移和随后激活的叶绿素淬灭中的作用。通过分离高阶非线性信号，该研究还验证了NPQ与激子扩散长度之间的关系，将我们对陆地植物NPQ的基本理解与类囊体膜中的激子动力学联系起来。
编者声明：由于研究内容非常专业，难免有些理解不准确或者编辑整理的疏漏，请以英文原文为准。
