叶绿素（Chl）是一种必需的光合色素，但也是一种强光敏剂。过量的游离叶绿素及其前体会对光合生物造成氧化损伤。蓝藻是最古老的产氧光合生物，也是叶绿体的祖先（根据内共生起源学说，叶绿体被认为是起源于古代蓝藻与原始真核细胞的共生事件。）。由于其复杂的栖息地，蓝藻需要精确调节叶绿素合成以响应环境条件的变化，尤其是光强的变化。叶绿素合成酶由 chlG 编码，是催化叶绿素生物合成最后一步的酶，与光合作用生物发生密切相关。然而，chlG 的转录调控仍不清楚。2024年9月25日，华中师范大学生命科学学院邱保胜教授课题组在Plant Physiology在线发表题为The transcription factor RppA regulates chlorophyll
and carotenoid biosynthesis to improve photoprotection in cyanobacteria的研究论文。文章揭示了ChlG在Chl生物合成中的重要性，首先研究了其在蓝藻(Synechocystis sp. PCC 6803)中的转录水平调控。通过酵母单杂交（Y1H）文库筛选，发现一个转录因子RppA与chlG的启动子结合。rppA基因敲除突变体在光暗转换条件下会导致更多的ROS积累和生长抑制，这归因于rppA基因敲除突变体中chlG的过度上调和类胡萝卜素合成基因的上调受到抑制。这些结果表明，RppA在蓝藻适应水体频繁的明暗变化过程中起着至关重要的作用。菌株：集胞藻 PCC 6803（Synechocystis sp. PCC 6803），作为野生型和 rppA 敲除突变体的来源菌株。它是一种常用于光合作用研究的模式蓝藻，其基因组测序已完成，为研究基因功能等提供了便利。聚球藻 PCC 7002（Synechococcus sp. PCC 7002），用于验证 RppA 功能在不同蓝藻中的普遍性。不同蓝藻物种在生态环境和生理特性上可能存在差异，选择聚球藻 PCC 7002 有助于探究 RppA 相关调控机制在蓝藻中的保守性或多样性。菌株在特定光照和温度条件下培养。
rppA-KO 突变体的构建：通过删除 rppA 基因的部分序列并插入卡那霉素抗性盒构建 rppA 敲除突变体，经 PCR 验证和 RT-qPCR 分析确认。
Y1H 实验：利用酵母单杂交文库筛选与 chlG 启动子相互作用的转录因子，验证 RppA 与 chlG 启动子的结合。
非光化学猝灭（NPQ）的测量：使用叶绿素荧光仪WATER-PAM（德国WALZ）进行测量。样品在测量前先暗适应 15 分钟，在光化光（49 μmol photons m⁻² s⁻¹）下光适应后，通过饱和光脉冲（800 毫秒，3000 μmol photons m⁻² s⁻¹）测定 Fm' 值，然后向样品中加入 20 μM 的 DCMU，并测定存在 DCMU 时的最大荧光产量，得到 FmDCMU。根据公式 NPQ = (FmDCMU - Fm')/Fm' 计算非光化学猝灭值。
使用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)、电泳迁移率变化分析(EMSA)、高效液相色谱(HPLC)等方法来分析基因表达、蛋白-DNA相互作用和色素含量。• RppA能够直接结合到chlG的启动子上，并且对chlG基因的表达起到抑制作用。• rppA基因敲除突变株在暗-光转换条件下生长缓慢，并出现严重的氧化损伤。• 在暗光转换过程中，rppA敲除突变株中叶绿素及其前体物的积累显著增加，而叶绿素合成相关基因(chlG)的转录表达显著上调。• RppA能够同步促进类胡萝卜素生物合成相关基因的转录，增强类胡萝卜素的合成。这些结果揭示了蓝藻在频繁的暗-光转换条件下，通过减缓叶绿素的生物合成和促进类胡萝卜素的生物合成来避免氧化损伤。![]()
图1 RppA与chlG启动子的直接结合。（A）chlG 启动子区域示意图，（B）通过 Y1H 实验验证 chlG 启动子与 RppA 的相互作用，（C）GST-RppA 融合蛋白的纯化及 SDS-PAGE 分析，（D）通过 EMSA 分析 chlG 启动子与 RppA 的相互作用。
图2 rppA基因敲除突变株的构建和鉴定。（A）rppA-KO 在集胞藻基因组中的敲除策略，（B）通过 PCR 分析野生型和 rppA-KO 的基因组 DNA，（C）通过 RT-qPCR 检测野生型和 rppA-KO 中 rppA 的转录水平。
图3 rppA基因敲除突变株在不同光照条件下的生长和氧化损伤情况。
图4 在较高光照强度（80μmol photons m⁻² s⁻¹）下，野生型和rppA基因敲除突变株的生长和氧化损伤情况。图5 rppA基因敲除对叶绿素生物合成的影响。
图6 野生型和rppA基因敲除突变株中类胡萝卜素含量的分析。
图7 RppA对类胡萝卜素生物合成基因转录的调控。
图8 RppA在聚球藻中可能的相似作用。
图9 RppA与Hik2的相互作用以及RppA功能的模型。
Yu C., Xu H. F., Liu Y. R., et al. Marine heatwave-driven mass mortality and microbial community reorganisation in an ecologically important temperate sponge[J]. Plant Physiology, 2024, kiae502.• 不同的FeS簇光损伤对于调控通过光系统I的过量电子流动至关重要
