精诚济世 明道致远
心动过缓是常见的心血管疾病，它可以导致晕厥、休克甚至死亡。心动过缓的主要病变细胞为心脏起搏细胞。目前，心动过缓的治疗手段主要是药物和心脏起搏器。遗憾的是，无论是药物，还是心脏起搏器，它们都不能从根本上改变病变的起搏细胞。
2024年9月6日，同济大学附属东方医院心脏病全国重点实验室陈义汉教授团队在Signal Transduction and Targeted Therapy上发表题为“A new paradigm for generating high-quality cardiac pacemaker cells from mouse pluripotent stem cells”的研究论文。本研究利用多能干细胞成功地诱导分化出心脏起搏细胞样细胞（注：以下简称为起搏样细胞），该项细胞诱导分化技术具有分化效率高、分化出的起搏样细胞起搏功能好等显著的优势和特色。同时，该论文展示了独特的起搏样细胞的诱导分化范式，绘制了起搏样细胞的分化轨迹，鉴定出调控起搏样细胞分化的关键基因—Zfp503，为心脏生物起搏技术的研发提供了重要数据。
心脏起搏细胞的特异性标记物有Shox2、Tbx18、Tbx3、Vsnl1和Hcn4等。其中，Shox2和Hcn4在起搏细胞的出现、发育和成熟过程中表达上调并发挥重要功能。研究人员首先利用CRISPR/Cas9技术成功构建了心脏起搏细胞特异性标记物Shox2:EGFP;
Hcn4:mCherry双荧光报告小鼠胚胎干细胞系。研究者通过DNA测序以及转录和蛋白水平等的检测，结合传统的拟胚体(Embryonic
body, EB)分化方法，验证了该双荧光报告细胞系被正确编辑且分化能力正常。随后，基于小鼠胚胎发育研究，研究人员在体外模拟了多能干细胞由幼稚态(naïve
state)向形成态(formative
state)的转变。在诱导转化为形成态干细胞之后，发现幼稚态标记物Nanog、Tbx3和Esrrb表达下调，多能性标记物Oct4表达相对稳定，而形成态标记物Otx2、Oct6和Fgf5的表达明显地升高。接下来，研究人员将其诱导分化为中胚层细胞，结果发现整体的分化效率很高，同时中胚层标记物(T、Flk1、Mesp1、Nkx2-5等)的表达显著增加，证明了种子干细胞同质性的提高对于分化的正向促进作用。
同时，研究人员探索了起搏样细胞分化相关的信号通路(Activin/Nodal/TGF-β、WNT和RA信号通路)的调控方式，并针对不同信号通路优化了操作时间窗，成功开发了高效诱导起搏样细胞分化的小分子化合物组合，最终建立了名为FSK的起搏样细胞分化方案。与传统的EB方案相比，在分化第13天时，FSK方案的心脏起搏细胞(Shox2、Hcn4、Vsnl1、Cacna2d2、Rgs6和Tbx5)和心肌细胞(Tnnt2和Nkx2-5)标记物表达明显升高，而心室肌细胞(Myl2和Cx43)标记物表达降低，证明FSK方案显著提高了心脏谱系分化的整体效率，并且增加了分化细胞群中起搏样细胞和心房肌样细胞的分化效率。
研究人员通过在体和体外等多层面的基因表达及电生理学鉴定，包括转录水平检测、细胞成像分析、单细胞膜片钳记录自发动作电位和If电流、微电极矩阵检测和在体起搏样细胞移植以及心电标测等，证明SHOX2+; HCN4+细胞亚群不仅具备了起搏细胞的表达特点以及形态特征，而且具有明确的起搏功能。
图1. 心脏起搏样细胞FSK分化方案的建立
其次，研究人员在不同的分化阶段（第5、8、13天）进行了单细胞转录组测序分析，将细胞分为了16个亚群，包括心室肌样细胞、心房肌样细胞、心肌成纤维细胞、心脏起搏样祖细胞、新生中胚层细胞、内皮细胞以及起搏样细胞等。GO基因功能分析发现，起搏样细胞亚群中，心脏收缩、离子通道以及心脏发育等相关基因的表达上调。在FSK方案诱导小鼠胚胎干细胞分化成为起搏样细胞的过程中，心脏起搏细胞标记物Shox2和Hcn4的表达丰度显著提高，两者共表达的细胞与细胞亚群分析中所定义的起搏样细胞亚群相拟合，证明了使用Shox2和Hcn4双重标记来定义起搏样细胞的准确性。
随后，研究者提取了起搏样细胞分化过程中的关键细胞亚群进行了拟时序分析，成功地绘制了多能干细胞向中胚层细胞、心脏祖细胞、心脏起搏样祖细胞的逐级分化以及最终形成起搏样细胞的分化轨迹。结果提示起搏样细胞的分化轨迹主要分为两个分支，其中成功分支分化为起搏样细胞(Shox2+;Hcn4+)，而失败分支则往心脏成纤维细胞(Col1a1+)方向分化。将起搏样细胞亚群与公共数据库中胚胎13.5天的小鼠窦房结细胞单细胞测序数据库进行分析对比，发现两者高度相似。以上结果证明，FSK方案诱导的起搏样细胞的分化过程及最终获取的起搏样细胞，与在体的心脏起搏细胞的分化过程及细胞特征均相似。
图2. 单细胞转录组测序揭示心脏起搏样细胞表达特征
最后，团队对拟时序分析得到的差异基因进行深入挖掘，发现了转录因子Zfp503在调控起搏样细胞分化中的全新功能。单细胞转录组数据显示，在细胞离开中胚层阶段进入起搏样细胞方向的分化阶段之后，Zfp503被显著激活且明显富集于整个分化过程之中。在不同分化时间点以及不同细胞亚群中的基因表达检测也证明了上述结论的正确性。免疫组化实验结果显示，ZFP503在胚胎期小鼠窦房结起搏细胞中与HCN4共定位，证明了Zfp503在体内外的心脏起搏细胞中都表达。研究者在体外分化实验中还发现Zfp503以浓度依赖的方式响应RA信号通路，并且与SHOX2+; HCN4+细胞亚群的分化效率紧密相关。反之，Zfp503的缺失则会严重影响起搏样细胞的分化效率，证明了Zfp503在起搏样细胞的分化过程中的重要作用。本研究揭示，Zfp503是介导RA信号通路参与起搏样细胞分化的关键因子，对起搏样细胞的分化具有十分重要的调控作用。
图3. Zfp503参与调控心脏起搏样细胞的分化
综上所述，该研究报道了高效的起搏样细胞分化的方案，提供了起搏样细胞分化的全景图像，描绘了起搏样细胞的分化轨迹，加深了对心脏传导系统发育机制的理解。FSK分化技术的建立，以及Zfp503在调控起搏样细胞分化中关键作用的揭示，为生物起搏器的开发提供了潜在重要的细胞资源，为起搏细胞的生理学功能研究和疾病干预研究提供良好的工具细胞。特别有意义的是，该技术的诞生将从细胞资源和疾病模型上帮助起搏细胞相关疾病的新药开发。
图4. 心脏起搏样细胞分化及ZFP503作用模式图
本论文的通讯作者为陈义汉院士（同济大学附属东方医院心脏病全国重点实验室、同济大学附属东方医院心脏内科、同济大学医学院病理与病理生理学系）和杨健教授（同济大学附属东方医院心脏病全国重点实验室）。论文的第一作者为同济大学林哲伊（博士后）、林博文（博士）、杭成文（博士生）和卢仁宏（博士生）。
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