拔高贴 | 高分辨质谱杂质鉴定~

企业   2024-09-24 07:59   上海  

杂质分析是医药化工行业产品开发和生产过程中的重要组成部分。
对于新原料药,ICH 指南Q3A(R2)规定含量大于或等于 0.05%的杂质必须报告,含量大于等于0.1%的杂质必须鉴定。

举个栗子


液相主成分检测,DAD检测器得到的色谱图,局部放大后如下图:
杂质3含量大于上述规定,如何鉴定呢?
需要借助高分辨质谱!通过LCQTOF进行分析,得到质谱信息,最终推测它的分子式和结构!


不过这个过程往往也会遇到很多挑战

挑战1,进样浓度太高污染质谱系统

使用LCQTOF分析杂质时,为了看到杂质峰,就需要进高浓度大进样体积的样品,这样主成分浓度太高,如果在杂质前出峰且分离度不够,还会抑制杂质的响应,同时污染体系。
针对这类问题,我们可以利用质谱上的两位六通阀,把主成分切到废液去。以上面的案例来说,在Masshunter软件上可以设置不同的时间点,做质谱上的阀切。

0-32min toMS,32min to waste,42min再且切回来,使主成分不会进入质谱系统

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挑战2,液相条件和质谱不兼容


为了改善色谱分离,常使用磷酸缓冲盐、硫酸盐或离子对试剂等添加剂。但这些难挥发的添加剂对质谱不友好,会污染离子源并抑制离子响应


相关阅读如何准备LCMS的流动相

针对此类问题,可采取2D-LC的单中心切割如下图,第一维保持原始色谱条件,设置目标物保留时间作为阀切时间,切入第二维,使用质谱兼容流动相打进QTOF。

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单中心切割适合于只有1-2目标杂质,且2个目标杂质分离度足够高,需要在一台LC的基础上再加装泵、阀和检测器(或是质谱)。

相关阅读 单中心切割在LCMS的应用


挑战3,不同的液相,不同的结果!


HPLC品牌千千万万,不同型号的仪器设计构造不同,其中延迟体积和死体积是导致方法转移结果不同关键因素,因为它影响了流动相的混合行为,这将引起保留时间与分离度的变化。

上图中,右侧虚线为预设梯度,实线为混合行为
左侧为结果差异


这就是为什么,我们一直纳闷“为什么方法、流动相、色谱图一模一样”,现在到LCQTOF上,却找不到目标峰了

给大家推荐一个工具,安捷伦智能模拟技术 (ISET) ,通过转换算法,模拟原系统改变混合行为。换句话就是,安捷伦的全能泵可以模拟不同品牌和型号的LC,使得谱图完美重现。

ISET可以在 1290 Infinity II LC 或 1260 Prime LC上实现

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书接上面


杂质3在一维重现,通过阀被切入QTOF,二维通过全扫得到总离子流图,在TIC图上,找到强度高的色谱峰并提取质谱图,扣除背景后得到其质谱信息及局部放大图,如下图所示。
相关阅读 如何提质谱及扣背景
选中强度高的离子及其同位素,进行分子式生成(根据m/z精确数值推测目标物的分子式)。

最后,基于杂质的相关信息,对杂质的结构进行分析确认。对于目标物的确认工作,还需要我们对主成分和可能产生的杂质有一定的了解。比如元素组成、不饱和度、是否含有某些特征官能团等,这就需要丰富的谱图解析经验。

--选自《在线脱盐技术在药物杂质中的应用 》


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图文编辑:邢宇


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