全村人的希望，肿瘤免疫治疗新进展：ACOD1

转移会导致与乳腺癌相关的死亡，肿瘤浸润性中性粒细胞（TINs）会造成免疫抑制并促进转移。抑制TINs可能会增强免疫疗法，但要确定在TINs中高表达且在肿瘤外中性粒细胞中低表达的治疗靶点，仍是一项挑战。小编为大家带来这篇2023年10月发表在Cell Metabolism（IF= 29）上的文章，本研究利用单细胞 RNA 测序技术比较了小鼠乳腺肿瘤模型中的 TINs 和循环中性粒细胞，发现乌头酸脱羧酶 1（Acod1）是小鼠 TINs 中上调幅度最高的代谢酶，并验证了 Acod1 在人类 TINs 中高表达。Acod1通过GM-CSF-JAK/STAT5-C/EBPβ途径被激活，产生衣康酸，从而介导Nrf2依赖的铁死亡并维持TINs的持久性。抑制Acod1可减少TIN浸润、抑制转移（但不能抑制原发肿瘤）、增强抗肿瘤T细胞免疫力并提高免疫检查点阻断剂的疗效。研究结果揭示了TINs如何通过Acod1衣赖的免疫代谢转换摆脱铁死亡反应，并将Acod1确定为抵消免疫抑制和改善抗肿瘤转移免疫疗法的靶点。

中性粒细胞通过乌头酸脱羧酶 1 抵抗铁死亡并促进乳腺癌转移

一、Highlight：

1. Acod1 是小鼠和人类肿瘤浸润性中性粒细胞中一种上调的酶；

2. Acod1 的上调是由 GM-CSF-JAK/STAT5-C/EBPβ 信号通路驱动的；

3. 衣康酸可抵御铁死亡并在转移过程中保护中性粒细胞；

4. 抑制Acod1可提高免疫检查点阻断药（ICB）的抗转移疗效。

二、研究背景

转移是乳腺癌（BC）死亡和发病的主要原因，免疫检查点阻断（ICB）药物与化疗联合使用，被批准用于治疗PD-L1+转移性三阴性乳腺癌（TNBC）患者。包括 BC 在内的各种癌症患者中，中性粒细胞与淋巴细胞比值（NLR）的升高是预测死亡率的一个独立指标。大量临床前研究证实， TINs与包括 BC 在内的 25 种癌症类型的不良预后关系最为密切，并证实了 TINs 的促肿瘤和促转移功能，而 TINs 的抗肿瘤活性通常出现在早期疾病中。实体瘤可上调细胞因子，诱导粒细胞增生，而 G-CSF 和 GM-CSF 等细胞因子可促进延长TINs 存活期。TINs 促进肿瘤或转移的一个主要功能是抑制效应 T 细胞和自然杀伤细胞，这表明 TINs 与多形核髓源性抑制细胞具有同等特性。对 BC 而言，富含 TINs 的肿瘤微环境（TME）会对 ICB 产生抗药性。将免疫抑制性 TINs 清除或作为治疗靶点与免疫疗法结合有望产生协同疗效，当仍需解决安全性方面的挑战。一种可能的方法是找到在肿瘤中性粒细胞中高度表达但在肿瘤外中性粒细胞中不表达或低表达的治疗靶点。

乌头脱羧酶 1（Acod1）催化乌头酸（三羧酸循环的中间体）到衣康酸的反应，衣康酸具有全面的抗炎作用及免疫抑制等活性。大多数关于 Acod1 的研究都集中在巨噬细胞上，Acod1 在中性粒细胞（尤其是 TINs）中的功能尚不明确。

在这里，应用单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术，发现Acod1是TINs中上调最多的酶编码基因。Acod1是阻碍TINs铁死亡和促进肺转移的关键。抑制Acod1的表达提高了细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的抗转移活性。这些发现将中性粒细胞免疫代谢重新布线与转移中的免疫抑制屏障联系起来，Acod1有望成为TINs的生物标记物和治疗靶点。关于TIN如何避免铁变态反应以保持存活和免疫抑制的发现，支持了目前开发铁死亡诱导剂作为潜在癌症治疗手段的努力。

三、主要研究结果

1.乳腺TME中的 TINs 具有强大的免疫抑制作用

为了研究 TINs 在 BC 中的作用，使用了同种异体和自发性小鼠乳腺肿瘤模型，确定了中性粒细胞的特征，并证实它们在血液、乳腺肿瘤和肺转移灶中大量聚集（图 1A），肺转移灶中的 TINs 含量比原发肿瘤高出 4 倍。与来自无肿瘤和有肿瘤小鼠的血液中性粒细胞（BNs）相比，来自E0771小鼠的TINs能有效抑制CD4+和CD8+T细胞的增殖（图1B）。

2. scRNA-seq揭示了TINs与血液中性粒细胞之间不同的转录组

为了确定TINs特有的基因表达变化，研究使用Drop-seq进行了分析（图1C），BNs 和 TINs 在 tSNE 图上被明显区分开来，显示出不同的转录组活动（图 1D）。无偏聚类分析确定了 6 个中性粒细胞聚类，C1-C5 为 BNs，C0 为 TINs（图 1D）。对 BNs 和 TINs 之间差异表达基因的生物反应通路分析（IPA）发现， TINs 中多个通路的富集（图 1E）。在差异表达的基因中，免疫细胞吸引和免疫抑制中具有已知功能的基因在TINs中上调（图 1F 和 1G）。为了确定与代谢相关的基因表达变化，分析了在 BNs 和 TINs 中KEGG 目录代谢酶基因的表达。TINs 上调了一组酶，包括介导前列腺素 E2 产生的Ptgs2，其可诱导免疫抑制（图 1F 和 1H），而Acod1 是上调最明显的酶编码基因（图1H）。

图1 乳腺 TME 中的中性粒细胞表现出强大的免疫抑制和独特的转录组特征

3．在小鼠和患者的原发性和转移性BC中， TINs 中的Acod1 高度表达

研究通过各种方法检测了 Acod1 的表达，与E0771小鼠或无肿瘤肺的血液白细胞相比，Acod1蛋白在乳腺肿瘤和肺转移灶的表达量明显更高（图2A）。在三种模型中，肺转移灶和原发肿瘤中性粒细胞表达的 Acod1 水平远高于骨髓、血液或脾脏的中性粒细胞（图 2B）。当比较无肿瘤小鼠和肿瘤小鼠时，来自血液和骨髓的中性粒细胞表达 的Acod1 水平同样可以忽略不计，肿瘤小鼠脾脏中性粒细胞表达的Acod1 水平中等偏上，而小鼠肺转移瘤中性粒细胞表达的Acod1 水平显著偏高。这一结果表明，肿瘤小鼠中性粒细胞中Acod1 表达的升高是由于肿瘤而非特定组织环境的影响。为了检测 Acod1 在不同免疫群体中的表达，进行了免疫荧光（IF）联合染色或 qRT-PCR，Acod1的表达仅限于髓系细胞，TINs表达Acod1的水平最高（图2C-2E）。在E0771定植的肺中，超过80%的Ly6G+细胞表达Acod1（图2F和2G），而在无肿瘤的肺中检测不到Ly6G+细胞。

为了研究Acod1在人类癌症中的表达模式，探索了TCGA数据库，发现与正常组织相比，ACOD1在多种癌症类型（包括BC）中高表达。此外，对 BC TCGA 数据进行的 GSEA 分析表明，中性粒细胞基因特征在 ACOD1 高表达的样本中富集。使用人类原发性 BC 标本，将 ACOD1 与 CD15 或泛角蛋白共染，结果显示，在 >85% 的 CD15+ 细胞中ACOD1 显著表达，但在泛角蛋白+癌细胞中则检测不到（图 2H 和 2I）。对于scRNA-seq，分析了 GSE169246的血液和各种转移灶。与小鼠模型的结果一致，ACOD1 在不同转移部位的免疫细胞中主要由中性粒细胞和巨噬细胞表达，但在血液中没有表达（图 2J）。总之，这些结果表明在小鼠模型和人类患者中，Acod1 在原发性和转移性 BC 的 TINs 中都过表达。

图2Acod1 在小鼠和患者的原发性和转移性 BC TINs 中高表达

4. 中性粒细胞 Acod1 促进小鼠 BC 模型的肺转移

为了评估Acod1的功能，用标记mcherry或TR（tk-GF-荧光素酶三重报告基因）的E0771来评估野生型（WT）和Acod1-/-小鼠的原发性肿瘤和肺转移（图3A）。原发肿瘤的生长速度相似，但 Acod1-/-的肺转移负荷明显低于 WT（图 3B 和 3C），这与 Acod1-/-小鼠的存活期延长（图 3D）相对应。相反，对静脉注射 E0771-TR 处理 的WT 小鼠进行PBS或DMI治疗（图 3E），DMI 促进了肺转移并缩短了存活期（图 3F-3H），但 DMI 并不影响原发肿瘤的生长。

将 WT 和 Acod1-/-小鼠的骨髓细胞在 E0771 条件培养基（CM）中培养 3 天，然后用αLy6G 纯化骨髓源性的中性粒细胞（BMDNs）（图 3I），WT 而非 Acod1-/-小鼠的 BMDNs 显示出 CM 诱导的 Acod1 表达（图 3J）。与接受CM诱导的WT BMDNs的小鼠相比，接受CM诱导的Acod1-/-BMDNs的小鼠肺转移较少（图3K和3L），存活时间较长（图3M）。相比之下，PBS 组转移最少，存活时间也长于注射 BMDNs 的两组。可以明显看出，两组 ACT 受体小鼠的存活期都比未接受 ACT 的小鼠短，WT 组和 Acod1-/-BMDN 转移组之间两条生存曲线的分离证明了 Acod1 在中性粒细胞中的作用。

研究建立了 MMTV-PyMT Acod1+/+ 和 MMTV-PyMT Acod1-/-队列，与 E0771 模型的结果一致，Acod1 的缺乏不影响原发肿瘤的发生，但却显著减少了肺转移灶的数量（图 3N 和 3O）。

为了特异性地消除中性粒细胞中 Acod1 的表达，建立了三个队列：LysM-Cre+Acod1f/f、Mrp8-Cre+Acod1 f/f和 Ly6G-Cre+ Acod1 f/f。静脉注射 E0771 的LysM-Cre+Acod1 f/f和 Mrp8-Cre+Acod1 f/f小鼠肺转移较少（图 3P），存活时间也比 Acod1 f/f对照组小鼠长（图 3Q），而 Ly6G-Cre+ Acod1 f/f则没有差异。

图3 中性粒细胞 Acod1 促进小鼠 BC 模型的肺转移

5. 肿瘤分泌的 GM-CSF 通过 STAT5-C/EBPβ 轴诱导中性粒细胞中Acod1表达

研究通过在ER-Hoxb8-DNs中加入肿瘤细胞CM生成TIN样细胞（图4A），来自 4 个小鼠BC细胞系的 CM 均诱导了 Acod1在 ER-Hoxb8-DNs （图 4B）和 BMDNs中表达。细胞因子水平检测到的8 种因子中，只有 GM-CSF 能显著上调 ER-Hoxb8-DNs 中的Acod1表达（图 4C）。

GM-CSF 下游转录因子之一 CCAAT/增强子结合蛋白-β（C/EBPβ）被 GM-CSF 和肿瘤 CM 强力诱导（图 4C）。在Drop-seq 中，Acod1 和 Cebpb 都被 TINs 独家表达，而不是 BNs（图 4D）。用 shRNA 敲除 ER-Hoxb8-DNs 中的Cebpb可减弱 GM-CSF 对 Acod1 的诱导（图 4E）。抗 GM-CSF 治疗降低了 E0771-CM 诱导的 BMDNs 中 C/EBPβ 和 Acod1 的表达（图 4F）。这表明 GM-CSF 在诱导中性粒细胞表达 Acod1 中起着关键作用。GM-CSF 与 GM-CSF 受体结合并激活 JAK-STAT 通路，尤其是中性粒细胞中的 JAK2 和 STAT3/5。STAT5 抑制剂（STAT5-IN-1）而非 STAT3 抑制剂，抑制了 C/EBPβ 和 Acod1 的表达（图 4G）。这些结果表明，肿瘤分泌的GM-CSF通过STAT5-C/EBPβ 途径诱导TINs中的Acod1表达（图4H）。

图4 肿瘤分泌的 GM-CSF 通过 STAT5-C/EBPβ 轴诱导中性粒细胞中的 Acod1表达

6. Acod1 通过抑制铁死亡维持 TINs 的存活

与正常中性粒细胞相比，肺转移瘤中的中性粒细胞会产生更多的活性氧（ROS）。研究对从肺转移瘤中分离出的 TINs 进行了细胞 ROS、脂质 ROS 和线粒体 ROS 量化分析。缺乏 Acod1 的 TIN所有三种 ROS 类型的水平均升高（图 5A-5C）。ROS 是诱导中性粒细胞死亡的必要条件，因此，TINs 中 Acod1 缺失导致的 ROS 增加可能会导致更明显的死亡。事实上，Acod1 的缺失导致转移瘤内 TINs 的频率和存活率显著下降，但并不影响 BNs 和脾脏中性粒细胞的存活率（图 5D-5F）。

铁死亡是由过量的 ROS负荷和脂质过氧化引发的铁依赖性细胞死亡。研究用药物或Fer-1处理了携带 E0771-TR 肺转移瘤的 WT 小鼠和 Acod1-/-小鼠。Fer-1 显著恢复了 Acod1-/-小鼠的转移负荷（图 5G）和 TINs 丰度（图 5H），达到与 WT 小鼠相当的水平。

为了再现 Acod1 在体外抵抗 TME 诱导的中性粒细胞铁死亡的现象，研究在存在或缺乏Fer-1和4OI的条件下，用WT或Acod1-/-小鼠的GM-CSF培养的BM细胞，在E0771乳腺肿瘤外植体上清液（TES）中处理（图 5I）。与 WT BMDNs 相比，TES 使Acod1-/-BMDNs 产生更明显的脂质过氧化和活力丧失，重要的是，当用 4OI 或 Fer-1 处理细胞时，这种差异被消除（图 5J-5L）。综上所述， Acod1 的过表达能保护 TINs 免于铁死亡影响，从而使 TINs 在转移性 TME 中积累。

图5 Acod1 通过抑制铁死亡维持 TINs 的存活

7. Acod1 通过激活 Nrf2 介导的抗氧化反应来削弱 TINs 铁死亡作用

证据表明，Acod1 可通过激活Nrf2依赖性抗氧化反应，将 TINs 从铁死亡中解救出来。研究检测了从 WT 小鼠和 Acod1-/-小鼠 E0771 肺转移瘤中分离的TINs中Nrf2的表达，观察到Acod1缺失导致Nrf2蛋白的显著降低（图 6A），尽管Nrf2的mRNA水平没有改变（图 6B）。与 Nrf2 的功能一致，Acod1-/-TINs 显著下调了以 Gpx4、Gclc 和 Nqo1 为代表的抗氧化基因的表达，所有这些基因都参与了铁死亡抵抗（图 6C）。用 Nrf2 抑制剂处理转移小鼠可消除 WT 和 Acod1-/-TINs 之间这些基因的差异表达（图 6C）。

此外，ML385 使 WT TES 激活的 BMDNs 的脂质过氧化水平升高，细胞存活率降低，与 经ML385 处理的 Acod1-/-TES 激活的BMDNs 水平相当（图 6D-6F）。相反，NK252 可降低脂质过氧化，提高 TES 处理的 Acod1-/-BMDNs 的细胞活力，并缩小 WT 和 Acod1-/-BMDNs 在 100 uM 时的差异（图 6G-6I）。进一步评估了 Acod1 缺失对谷胱甘肽细胞丰度的影响，与 Acod1-/-BMDNs 相比，WT BMDNs 含有更多的谷胱甘肽，而外源 4OI 或 DMI 会显著增加这两种 BMDNs 中的谷胱甘肽含量（图 6J 和 6K）。总之，这些数据阐明了 Acod1 产生的衣康酸可通过刺激 Nrf2 抗氧化途径来抵抗 TINs 铁死亡。

图6 Acod1 通过激活 Nrf2 介导的抗氧化反应来削弱 TINs 铁死亡作用

8. Acod1去除可促进适应性免疫并增强免疫疗法

Acod1 去除的转移抑制作用取决于适应性免疫，因为 Rag1-/-Acod1+/+ 和 Rag1-/-Acod1-/-小鼠表现出相似的 E0771-TR 肺转移负荷和存活时间（图 7A-7C）。研究使用了 E0771-TR 肺转移模型，观察到虽然 Acod1 去除和 ICB都能延长小鼠的生存期，但 Acod1-/-宿主用 ICB 治疗后生存期明显延长（图 7D）。静脉注射后第15天的免疫分型显示，Acod1 去除和 ICB 的组合可最大程度地降低肺组织的 TINs 密度（图 7E）。经 ICB 处理的 Acod1-/-队列在转移性 TME 中显示出最有利的抗肿瘤 T 细胞免疫状态，其特点是总CD8+ T、IFNγ+ CD8+ T、Gzmb+ CD8+ T 和总 CD4+ T 百分比最高，但 Treg 百分比最低（图 7F）。经 ICB 处理的 Mrp8-Cre+ Acod1f/f小鼠的存活时间明显长于经 ICB 处理的 Acod1f/f小鼠（图 7G）。当用 Fer-1 或载体处理 ICB 处理的Mrp8-Cre+ Acod1f/f小鼠时，Fer-1 会加速转移小鼠的死亡（图 7H），这表明中性粒细胞中的Acod1缺失会通过上调中性粒细胞的铁死亡来增强ICB。

图7Acod1去除可促进适应性免疫并增强免疫疗法

四、总结

研究证明，免疫抑制性TINs通过上调Acod1和产生衣康酸设法在转移性TME中存活，衣康酸激活了依赖于Nrf2的抗氧化反应，以逃避铁死亡并维持TINs在转移中的丰度（图7I）。GM-CSF 激活 STAT5-C/EBPβ通路驱动 Acod1 转录，与 TME 中的其他免疫群体相比，TINs 的 Acod1 水平最高。系统性或中性粒细胞特异性消融Acod1可减少TINs的存活和积累、减缓转移生长并延长免疫功能正常的BC小鼠的存活期，而衣康酸衍生物或CM激活的WT（而非Acod1-/-）中性粒细胞可促进肺转移并缩短动物存活期。宿主 Acod1 的缺失纠正了抗肿瘤 T 细胞的特征，提高了 ICB 治疗 BC 转移的有效性。

研究创新性提出Acod1在TINs中的作用与机制，补充了研究领域的空白，并为临床提供新的潜在治疗靶点，为患者带来希望。

Zhao Y, Liu Z, Liu G, Zhang Y, Liu S, Gan D et al. Neutrophils resist ferroptosis and promote breast cancer metastasis through aconitate decarboxylase 1. Cell Metabolism 2023;35:1688-703.e10.