细胞与细胞间的通讯对于维持生物体的正常功能和生理过程至关重要。此外，肿瘤微环境中异常的细胞互作与患者的预后及治疗应答密切相关。因此，基于细胞通讯模式预测癌症预后是目前的热点研究方向。单细胞及空转数据的增加也为研究细胞互作提供了助力。小编今天和大家分享一篇今年2月发表在Journal of Translational Medicine(IF:7.4)杂志上通过整合单细胞及bulk数据分析肿瘤相关巨噬细胞与耗竭T细胞互作与转移胃癌微环境关联，并构建互作相关特征预测临床结局的文章。
Potential crosstalk between SPP1+ TAMs and CD8+ exhausted T cells promotes an immunosuppressive environment in gastric metastatic cancer
SPP1+TAMs和CD8+耗竭T细胞的潜在互作促进胃转移癌的免疫抑制环境
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一．文章摘要
文章收集了健康胃、原发胃癌及转移胃癌的单细胞测序数据，研究也纳入了TCGA胃癌队列的表达及临床信息。文章首先基于单细胞数据分析了SPP1+肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)与CD8+耗竭T细胞在转移性胃癌中的相互作用，结果发现配受体GDF15-TGFBR2相关的互作可能发挥关键的免疫抑制作用。研究接着构建了一个配体受体(LR)评分量化基于配体和受体的相互作用。研究也分析了LR评分与各种免疫特征和临床分子亚型的关联。最后研究也验证了LR评分对免疫治疗疗效和预后的预测效能。
二．文章的主要内容及结果
1.健康胃、原发胃癌及转移性胃癌的单细胞异质性
研究首先刻画了正常胃组织、原发胃癌和转移性胃癌微环境的异质性。研究收集了胃癌单细胞公共数据，其中包括胃原发肿瘤、邻近非肿瘤和胃癌淋巴结转移、肝转移、卵巢转移和腹膜转移样本。研究经过质控后保留了44,234个细胞，并将其降维聚类为20个亚群(图1A)，接着根据标记基因将其注释为上皮细胞(EpiC1-C6)、内皮细胞、成纤维细胞、中性粒细胞、肥大细胞、巨噬细胞、CD4+T和CD8+T细胞等类型。接下来研究使用胃恶性和非恶性上皮的特异性基因区分恶性和非恶性上皮细胞，结果发现恶性上皮基因在EpiC1-C4中高度表达(图1B)，EpiC1- C4也表现出较高的胃癌评分(图1C)，研究将其命名为GC-C1-C4。研究分析也发现GC-C1和GC-C3主要存在于原发肿瘤中(图1D，E)，GC-C4主要存在于转移肿瘤中(图1D， E)，免疫细胞在正常组织、原发肿瘤和转移瘤样本中占比例更高(图1D，E)。此外，原发肿瘤中癌细胞所占比例显著大于转移瘤(图1D, E)。研究也分析了不同类型细胞的标记基因表达情况(图1F)。
图1 正常胃、原发胃癌和转移胃癌的单细胞图谱
2.不同胃癌患者间CD8+T细胞的状态
研究接着对不同样本组间CD8+T细胞的状态进行了分析。文章对CD8+T细胞重聚类分为7个亚群(C1-C7，图2A)。接着基于经典的标记基因分析细胞状态，结果发现C1和C2为幼稚样，C3为组织驻留记忆CD8+T细胞，C4为耗竭CD8+T细胞，C5为中间状态CD8+T细胞(图2B)。研究也识别了不同细胞亚群的标记基因(图2C)。研究通过伪时序分析发现不同状态细胞与肿瘤进展过程保持一致(图2D)。此外，研究也观察到衰竭CD8+T细胞在转移瘤中的比例远高于原发肿瘤(图2E)。
图2 推断CD8+T细胞的细胞状态
3.不同胃癌样本组间巨噬细胞异质性
文章接着分析了不同样本间巨噬细胞的差异。研究将巨噬细胞重聚类为5个亚群(图3A)，这些亚群都表达经典巨噬细胞标记基因(图3B)。这五种巨噬细胞亚群的标记基因如图3C所示。研究在正常胃组织中未发现TAMs亚群MACRO-SPP1、MACRO-INHBA和MACRO-GBP1(图3D)。接着研究评估了细胞的吞噬和血管生成能力，结果发现SPP1+TAMs具有更强的吞噬能力(图3E)。INHBA+ TAMs具有更强的血管生成能力(图3E)。研究也观察到M1和M2特征基因在5种巨噬细胞中共表达，不过MACRO-INHBA、MACROGBP1和MACRO-FCN1表现出更高的M1特征，MACRO-SPP1和MACRO-C1QC表现出更高的M2特征(图3F)。MACRO-SPP1也被发现在转移性肿瘤中的比例明显高于原发肿瘤(图3G)。
图3 巨噬细胞的重聚类和注释
4.转移性胃癌CD8+T细胞与巨噬细胞互作网络分析
文章接着分析了转移性胃癌中CD8+T细胞与TAMs的相互作用。研究评估了细胞相互作用强度，结果发现CD8+耗竭T细胞与SPP1+TAMs之间的互作强度在转移状态下显著增强(图4A)。进一步观察到转移胃癌中SPP1+TAMs的输出强度显著高于输入强度，CD8+T耗竭细胞的输入强度显著高于输出(图4B)。文章接着研究了不同状态下巨噬细胞与CD8+T细胞之间的详细信号通路(图4C)，结果观察到VCAM、GDF、MIF、TNF、CD137和ITGB2通路具有转移胃癌特异性(图4D)，且GDF信号通路仅由SPP1+ TAMs特异性发出(图4E)。
图4 巨噬细胞与CD8+T细胞的相互作用
5.转移胃癌中潜在的配体受体相互作用分析
文章接着对细胞互作涉及的配体和受体进行分析。研究发现GDF通路主要涉及GDF15和GFBR2相互作用(图5A)。转移状态下，GDF15在SPP1+ TAMs中高表达(图5B)。GDF15在肝转移样本中表达最高(图5C)。研究接着使用ssGSEA对CD8+T耗竭细胞特征基因和GDF15+SPP1+TAM特征基因进行评分，并根据GDF15+SPP1+TAM评分中位数将TCGA-STAD队列分为两组，结果发现高GDF15+SPP1+TAM评分样本的CD8+耗尽细胞的评分也高(图5E)。研究也发现免疫检查点基因的表达在转移CD8+T耗竭细胞中升高(图5F)。TCGA队列也验证了GDF15+SPP1+TAM评分与CD8+T细胞共抑制受体评分呈正相关(图5G)。
图5 潜在的配体和受体相互作用
6.TAMs与耗竭CD8+T细胞互作的实验验证
文章接着通过实验验证了TAMs与耗竭CD8+T细胞互作与转移胃癌的关联。研究首先通过脾下注射胃癌细胞建立了胃癌肝转移小鼠模型(图6A)。接着每周对小鼠进行活体荧光成像监测，观察肝转移模型的制备情况(图6B)。肿瘤生长三周后处死小鼠收集肝转移灶，经过多重免疫荧光观察到巨噬细胞标记物(CD68)、SPP1+TAM标记物(SPP1)和GDF15蛋白共定位(图6C)。接下来，为了进一步验证GDF15的免疫抑制作用，研究在胃癌肝转移模型小鼠中使用GDF15抑制剂(图6A)，结果发现GDF15抑制剂可有效减少肝转移数量(图6B, D-E)。同时，该结果也表明GDF15抑制剂能够逆转免疫抑制作用，增加CD8+T细胞的浸润(图6F-G)。
图6 动物实验验证巨噬细胞与CD8+T细胞的关联
7.构建CD8+T耗竭和SPP1+TAM相互作用评分
文章接着根据CD8+T耗竭细胞和SPP1+TAMs细胞互作构建了预后风险评分。研究可视化了SPP1+TAMs与CD8+T耗竭细胞相互作用网络(图7A)，评估了网络中配体及受体(L/R)的表达水平。研究在TCGA-STAD队列中观察到86%的L/R在胃癌样本中上调(图7B)。此外，34个L/R在正常和胃癌样本表达有差异(图7C)。研究接着基于所有L/R利用LASSO建立LR评分(图7D)，研究发现LR评分的多因素和单因素风险比都最高(图7E)。研究也观察到LR评分高患者的OS (图7F)、PFS (图7G)、DFS (图7H)和DSS (图7I)较差。此外，LR评分在评估预后方面比AJCC-TNM分期、病理分级、性别和年龄更有效(图7J)，1年、3年和5年的评估效能也良好(图7J)。
图7 LR评分用于量化相互作用
8.LR评分与免疫特征以及临床分子亚型的相关性
文章最后分析了LR评分与免疫特征以及临床分子亚型的相关性。研究观察到LR评分与大多数T细胞呈负相关，与M2巨噬细胞分数呈正相关(图8A)。此外，LR评分越高，CD8+ T细胞浸润越低，巨噬细胞浸润越高(图8B)。低LR评分具有较高的细胞溶解活性和促炎能力(图8C)。较高的LR评分与较高的TIDE评分相关(图8D)。研究也发现LR评分低患者的肿瘤突变负荷(TMB)较高(图8E)。研究也分析了MSI(微卫星不稳定性)、GS(基因组稳定性)、EBV (EB病毒感染)和CIN(染色体不稳定性)四种胃癌亚型与LR评分的关联，结果发现CIN和GS具有更高的LR评分，EBV和MSI的LR评分较低(图8F)。此外，研究也发现CIMP-H和CIMP-EBV亚型患者的LR评分较低(图8H)，而临床阶段较晚期患者的LR评分较高(图8I)。研究也分析了TCGA-STAD患者不同临床分子亚型患者的LR分布特征(图8J)。亚洲癌症研究组织(ACRG)将胃癌分为MSI-H、EMT、MSS/TP53-和MSS/TP53+四类，研究发现MSI-HLR评分最低，EMT的LR评分最高(图8K)。最后研究也发现诊断为弥漫性胃癌的个体LR评分最高(图8L)，这也表明ACRG患者LR评分分布和临床分子亚型特征不同(图8M)。
图8 LR评分与临床免疫特征的相关性研究
到这里文章的主要内容就结束了。文章基于单细胞数据分析了正常胃组织、原发胃癌及转移胃癌的肿瘤微环境，观察并验证了SPP1+TAMs细胞与耗竭CD8+T细胞的互作与胃癌转移密切相关。因此研究基于这两类细胞互作相关的配体受体基因利用组织数据构建并验证了LR风险得分。研究也对该得分进行了多角度分析，证明了该得分对胃癌患者的临床结局具有很好的预测作用。单细胞及空转数据的爆炸增长促进了细胞间通讯的研究，因此基于肿瘤微环境中不同细胞间的交互预测癌症预后及治疗应答也正在成为一个热点方向。感兴趣的小伙伴在开展自己课题时可以参考该文章的思路及角度。
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