免疫检查点抑制剂（ICIs）通过阻断免疫检查点与其配体的结合，解除免疫检查点引起的免疫功能抑制，从而重新激活免疫细胞，在许多实体瘤中取得了良好疗效，如PD-1、PD-L1、CTLA-4。然而，大多数患者对ICIs治疗无响应，无法从中受益。免疫治疗生物标志物可以预测免疫治疗效果，因此可以筛选患者进而制定合理的个体化治疗方案。
MHC，即主要组织相容性复合体，在抗原识别和抗原呈递环节发挥着不可替代的作用。在ICIs疗法中，MHC正确呈递肿瘤抗原的能力直接影响到T细胞能否有效识别并攻击肿瘤细胞，因此，MHC的状态是预测ICI治疗响应的一个关键因素。
近期，在一篇发表于Cancer Lett的文章中，作者对多个scRNA-seq和bulk RNA-seq数据集进行了联合分析，设计了一种基于MHC的免疫治疗标志物——MHC.sig。该标志物不仅可以预测免疫治疗效果，而且将其与特定细胞类型联系起来。
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一、结果
1、基于泛癌scRNA-seq的MHC标志构建
首先，作者从2个scRNA-seq数据集（GSE115978，SKCM；GSE123813，BCC）筛选出21个MHC相关特征基因。
作者假设，单细胞水平上的MHC特征基因可以作为预测不同癌症类型ICIs疗效的指标。为了验证这一假设，作者利用34个scRNA-seq数据集，通过泛癌scRNA-seq数据集中MHC基因表达水平的筛选和CytoTRACE评分，构建了一个专门的MHC生物标志物，称为"MHC.sig"。如图1A所示，G1-G34代表了34个scRNA-seq数据集中不同癌症类型MHC.sig的分布。GO富集分析显示，与MHC.sig相关的基因在生物过程抗原处理和呈递中显著富集。在细胞组分方面，富集主要在MHC蛋白复合体、内质网膜的固有组分以及内吞囊泡膜上。在分子功能水平上，富集主要包括肽抗原结合、抗原结合和肽结合（图1B）。
图1：34个scRNA-seq数据集中不同癌症类型MHC.sig的分布及GO/KEGG富集分析
2、MHC.sig在结直肠癌（CRC）中细胞亚型的分布
在CRC中，为了进一步优化MHC.sig并评估其稳健性，作者对6位接受手术治疗的CRC患者进行了scRNA-seq分析。测序数据结果分析表明，CRC组织主要包括上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞、巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞、T细胞和B细胞（图2A），其基因标记见图2B。值得注意的是，IGFBP7在成纤维细胞和内皮细胞中表达相似，可能由于其在TME中的相似功能。而KRT18在上皮细胞中的表达显著更高，是恶性细胞的一个稳定标记。为了解决肿瘤异质性，作者在个体样本水平上比较了细胞类型组成（图2C）。不同类型的细胞在样本间表现出异质性，其中上皮细胞和T细胞主要占据了CRC TME的组成。此外，单核细胞和巨噬细胞在不同样本间似乎差异显著，单核细胞主要分布在CA3，而巨噬细胞在CA3和CA6中显示出主导比例。
图2 结直肠癌（CRC）scRNA-seq结果分析
由于MHC主要参与抗原呈递，激活细胞毒性T细胞，进而抑制恶性细胞，作者筛选了与CytoTrace评分相关性小于-0.2的关键MHC相关基因。通过与前述泛癌MHC.sig进行比较，得到了优化的MHC.sig基因：B2M, HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DPA1, HLA-DRA, HLA-DRB1, HLA-E, HLA-F, TAP1, TAPBP（图2D）。
接下来，为了评估这11个MHC.sig在不同细胞亚型中的富集，作者使用AUCell量化了CRC中不同细胞亚型中MHC.sig的水平，并比较了它们在不同细胞亚型中的富集。图2E显示，与其它细胞亚型相比，恶性细胞具有最低水平的MHC.sig。然而，MHC.sig的富集在巨噬细胞中最高，而不是在树突状细胞中。为了进一步探索MHC.sig与巨噬细胞之间的关系，作者重新聚类了巨噬细胞。巨噬细胞可以区分为SPP1+巨噬细胞和C1QC+巨噬细胞（图2F）。先前的研究表明，SPP1+巨噬细胞与较差的肿瘤预后相关，而C1QC+巨噬细胞主要发挥细胞吞噬和抗原呈递功能。作者的研究与这一发现一致，因为C1QC+巨噬细胞中MHC.sig的富集显著高于SPP1+巨噬细胞（图2G）。
3、泛癌RNA-seq揭示了MHC.sig与免疫激活相关
作者基于泛癌RNA-seq数据分析了MHC.sig与免疫相关基因、细胞、通路以及肿瘤内异质性和肿瘤突变负担的相关性，结果表明，MHC.sig与免疫激活状态呈正相关。
3.1 MHC.sig与免疫相关基因正相关
为了表征肿瘤内的免疫状态，作者编制了一组75个与免疫相关的基因，包括人类白细胞抗原（HLA）、免疫刺激因子和免疫抑制因子。随后，作者对MHC.sig与这三类免疫相关基因之间的关系进行了全面分析。正如预期的那样，MHC.sig与免疫相关基因的表达水平普遍呈正相关，只有HMGB1、ARG1和VEGFA显示出显著的负相关（图3A）。这表明肿瘤细胞可能通过上调MHC分子来增强抗原呈递，从而激活T细胞。然而，为了逃避免疫监视，肿瘤细胞也可能同时上调免疫检查点分子来抑制活化的T细胞，从而建立免疫逃逸机制。
3.2 MHC.sig与免疫相关细胞正相关
此外，作者还基于泛癌RNA-seq数据进行了去卷积分析，以评估肿瘤微环境中不同免疫细胞的浸润状态。MHC.sig的升高与细胞毒性免疫细胞和抗原呈递免疫细胞的显著增加相关，包括CD8+T细胞、NK、巨噬细胞和树突状细胞（图3B）。在大多数肿瘤类型中，中性粒细胞、内皮细胞和成纤维细胞与MHC.sig没有显著相关性（图3B）。此外，在肾脏透明细胞癌（KICH）中，MHC.sig与大多数免疫细胞没有显著相关性（图3B）。总之，这些结果表明，MHC.sig是一个跨癌症的信号，适用于表征泛癌的抗肿瘤免疫状态。
3.3 MHC.sig与免疫相关通路正相关
为了探索与免疫激活和免疫治疗反应相关的通路是否在高MHC.sig的肿瘤中上调，作者还分析了泛癌RNA-seq数据中与MHC.sig评分显著相关的标志性特征。图3C的结果揭示了在高MHC.sig肿瘤中，与干扰素相关的通路（干扰素-γ反应和干扰素-α反应）和炎症反应通路的显著富集（特别是在甲状腺癌和肺鳞状细胞癌中）。这些通路与有利的免疫治疗反应相关。
3.4 MHC.sig与肿瘤内异质性和肿瘤突变负担的相关性
肿瘤内异质性（ITH）和肿瘤突变负担（TMB）是两个不同的与免疫治疗相关的指标。ITH是一个与干细胞相关的指标，介导免疫抑制，而高TMB代表更有可能从免疫治疗中受益的患者。因此，作者检查了MHC.sig与ITH和TMB之间的关系。作者发现MHC.sig与ITH没有明显的相关性，但与TMB有显著的正相关。这表明MHC.sig是一个类似TMB的指标，表明在高MHC.sig的情况下对免疫治疗有更好的反应。
图3：MHC.sig与免疫激活相关
4、MHC.sig治疗靶点的筛选及ICIs反应评估
利用免疫反应相关CRISPR数据集和免疫治疗数据集，作者筛选了针对MHC.sig的治疗靶点，并重新评估了MHC.sig预测免疫治疗反应的潜力。作者收集了来自7个队列的CRISPR数据，总共有17个数据集，记录了22505个基因。根据平均z分数排序后，高z分数的基因被定义为免疫抵抗基因，而低z分数的基因被归类为免疫敏感基因。作者假设免疫抵抗基因的敲除可以增强抗肿瘤免疫，而免疫敏感基因的敲除可能导致免疫抑制。如图4A所示，前8个免疫抵抗基因包括VDAC2、RIC8、PTPN2、FITM2、SOCS1、ATG7、RAB7和RBCK1，而前8个免疫敏感基因包括TAP2、TAP1、B2M、JAK2、IFNGR2、IFNGR1、STAT1和JAK1。有趣的是，作为MHC.sig相关基因的B2M被确定为明显的免疫敏感基因。在研究中的22505个基因中，60%和80%的基因分别累计为13503和18004。接下来，作者计算了CRISPR数据集中MHC和免疫治疗相关特征基因中排名靠前的基因的百分比。结果显示，与其它免疫治疗疗效相关特征基因相比，MHC.sig相关基因在CRISPR数据集中识别出的潜在免疫治疗敏感基因的百分比更高（图4B）。在80%的基因中，8个MHC.sig相关基因，包括B2M、TAP1、TAPBP、HLA-DOA、HLA-DMB、HLA-DQA1、HLA-DMA和HLA-DRB1。这些MHC.sig相关基因被认为是免疫敏感基因，在多个独立的CRISPR数据集中得到了验证，并被认为是适合与ICIs协同作用于泛肿瘤的潜在治疗靶点（图4C）。
图4：MHC.sig治疗靶点的筛选及ICIs反应评估
作者进一步验证了MHC.sig在预测免疫治疗数据集中ICIs疗效的表现，并将其与之前建立的泛癌预测基因特征进行了比较。五个不同的免疫治疗数据集涵盖了四种不同的癌症类型（2个UC，1个SKCM，1个GC和1个RCC）。在调整了潜在的混杂因素后，作者发现在Gide SKCM（p = 0.02，图4D）、Kim GC（p = 0.01，图4E）和Mariathasan UC（p = 0.01，图4F）数据集中，高MHC.sig评分组的ICIs反应者比例显著高于低MHC.sig组。尽管在Bruan RCC和Snyder UC数据集中没有观察到统计学上的显著差异，但ICIs反应者在高MHC.sig组中明显富集。因此，作者推测具有高MHC.sig的患者更有可能从免疫治疗中受益。
作者还比较了MHC.sig与之前发表的免疫治疗疗效生物标志物（包括IFNG.sig、cytotoxic.sig、T.cell.inflamed.sig和PDL1.sig），结果表明MHC.sig在五个数据集中同样具有预测ICIs疗效的能力。
5、结合单细胞RNA测序和空间转录组分析的MHC.sig相关细胞通讯
由于MHC.sig在巨噬细胞中的显著富集（图2E），作者对CRC scRNA-seq数据进行了重新分析，以研究两种不同巨噬细胞亚型与恶性细胞之间的细胞通讯。
作者使用CellChat来识别CRC中特定细胞类型之间的分子相互作用，重点关注配体-受体对。使用圆形图和弦图，作者直观地表示了细胞通讯的强度和数量（图5A-B）。结果揭示了不同巨噬细胞亚型与恶性细胞之间相互作用的全局重编程。特别是，与SPP1+巨噬细胞相比，C1QC+巨噬细胞与恶性细胞的互动性增强。同时发现APP-CD74轴作为一个关键的调节轴，起源于恶性细胞，并在C1QC+巨噬细胞与恶性细胞之间的相互作用中起重要作用（图5C）。相反，当恶性细胞是目标细胞时，在C1QC+巨噬细胞中观察到一组特定的"受体-配体"相互作用，即COLLAGEN信号通路，该通路在涉及SPP1+巨噬细胞与恶性细胞的相互作用中是缺失的（图5D）。
图5：MHC.sig细胞通讯分析
为了进一步评估恶性肿瘤细胞和C1QC+巨噬细胞的空间特征，作者对单一CRC患者的空间转录组数据进行了重新分析。使用SPOTlight，作者在样本中注释了细胞类型，并基于无偏聚类和斑点特征识别了七种不同的细胞亚型。这些亚型包括恶性细胞、单核细胞、T细胞、树突状细胞、成纤维细胞、巨噬细胞和B细胞（图5E）。C1QC作为C1QC+巨噬细胞的生物标记，与恶性细胞的标记基因KRT18处于同一空间位置。通过推断C1QC+巨噬细胞和恶性细胞的空间浸润分数，结果表明两者之间存在显著的正相关（图5F）。说明在肿瘤微环境中，巨噬细胞试图清除恶性细胞或参与肿瘤相关的炎症反应。
6、基于C1QC+巨噬细胞和恶性细胞的最佳药物选择
最后，作者利用GDSC数据库中的药物治疗信息，计算了在不同组合的C1QC+巨噬细胞和恶性细胞背景下，药物在CRC队列中的敏感性特征。结果显示，在同时富集高C1QC+巨噬细胞和恶性细胞的样本中，有几种药物具有较高的药物敏感性，包括Afatinib、BMS-536924、Trametinib、Sapitinib、Lapatinib、SCH772984、ERK-6604、Acetalax和Ulixertinib（图6A-I）。这些发现为免疫治疗和化疗药物的选择提供了指导。
图6：基于C1QC+巨噬细胞和恶性细胞的药物选择
二、结论
基于单细胞数据集的34种不同肿瘤类型，作者构建了一个预测免疫检查点抑制剂疗效的MHC特征——MHC.sig。且巨噬细胞和树突细胞具有较高的MHC评分。巨噬细胞的经典分类包括两种亚型：M1型巨噬细胞，被认为可以抑制肿瘤进展，以及M2型巨噬细胞，被认为是促进肿瘤生长和转移。基于CRC样本的测序结果分析发现，巨噬细胞可以区分为SPP1+巨噬细胞和C1QC+巨噬细胞。先前的研究表明，C1QC+巨噬细胞主要参与吞噬作用和抗原呈递，高度表达与ICI治疗反应相关基因如CXCL9和CXCL10。相比之下，SPP1+巨噬细胞主要在促进血管生成和肿瘤转移中发挥作用，其特征基因与较差的预后相关。作者发现C1QC+巨噬细胞比SPP1+巨噬细胞具有更强的MHC特征，表明C1QC+巨噬细胞参与了CRC中的免疫监视，而SPP1+巨噬细胞的免疫功能有限。因此，针对SPP1可能是增强免疫疗法疗效的潜在策略。
作者进一步通过细胞通讯分析发现， C1QC+巨噬细胞与恶性细胞之间的交流主要通过APP-CD74轴介导。CD74是一种细胞表面分子，通过其分子伴侣功能参与抗原呈递，调节外源性肽进入MHC-II分子。APP参与抗原处理途径，编码MHC-I，增强T细胞介导的抗肿瘤免疫。APP-CD74轴可能在C1QC+巨噬细胞杀死肿瘤细胞中发挥重要作用。
作者还发现MHC.sig评分与肿瘤突变负担（TMB）水平之间存在显著的正相关。TMB是近年来在各种肿瘤免疫疗法中发现的独立生物标志物，可用于预测免疫疗法的疗效。高水平TMB的个体可以从ICI治疗中获得更大的临床益处。因此，MHC.sig评分高的患者可能具有免疫激活特征，更有可能对免疫疗法产生反应。作者在包括四种肿瘤类型的五个ICI治疗队列中证实了这一点。此外，作者将MHC.sig与先前的免疫治疗生物标志物进行了比较，发现MHC.sig在不同数据集中显示出最有希望的预测效果。因此，作者相信MHC.sig可以作为一种新的泛癌生物标志物，有效地预测ICI反应并成功区分患者的生存益处。
当然，该研究有一些局限性。首先，作者引用了不同的RNA-seq数据，可能引入错误和分类偏差。其次，结果的验证需要来自不同类型肿瘤的scRNA-seq数据，而作者仅进行了结直肠癌（CRC）的验证。第三，目前缺乏大规模癌症队列的蛋白质组数据，阻碍了在蛋白质水平上评估MHC.sig作为泛癌生物标志物的效果。此外，需要更多的ICI试验来评估和验证MHC.sig的预测价值。
总之，作者通过整合泛癌scRNA-seq和RNA-seq数据，构建了MHC.sig这一新的转录特征，以预测泛癌背景下的免疫治疗效果。作者分析了MHC与肿瘤微环境特征（包括C1QC1+和SPP1+巨噬细胞）的关系。为更有效的联合免疫疗法提供了指导。
参考文献
Feng HR, Shen XN, Zhu XM, Zhong WT, Zhu DX, Zhao J, Chen YJ, Shen F, Liu K, Liang L. Unveiling major histocompatibility complex-mediated pan-cancer immune features by integrated single-cell and bulk RNA sequencing. Cancer Lett. 2024 Jun 13;597:217062. doi: 10.1016/j.canlet.2024.217062. Epub ahead of print. PMID: 38878852.
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