肠脑轴研究思路主要围绕探索肠道与大脑之间的相互作用关系展开，这一领域近年来备受关注，因为它揭示了肠道和大脑之间复杂的双向通信系统，对于理解多种疾病的发病机制以及开发新的治疗策略具有重要意义。这篇文章利用宏基因组和代谢组联合分析，揭示微生物群落变化与代谢产物变化之间的内在联系，帮助理解微生物如何通过代谢活动影响宿主健康状态。
“肠脑轴双向通信”揭秘癌症的幕后玩家
探究肠道微生物与癌症之间功能机制
2024年7月发表在《Gut》（IF：23.0）的研究文章：“综合宏基因组学和代谢组学分析揭示了颅内动脉瘤中独特的阶段特异性肠道微生物衍生代谢物Integrated metagenomic and metabolomic analysis reveals distinctive stage-specific gut-microbiomederived metabolites in intracranial aneurysms”。文章系统地研究了肠道菌群及其代谢物对颅内动脉瘤 （IA） 进展的影响，以及源自肠道微生物组的精确相关代谢生物标志物。
一、背景
颅内动脉瘤（IA）破裂是一个极其有害的事件，目前缺乏有效的风险评估工具对IA进行早期诊断、大规模筛查、破裂风险预测和评估。同时随着代谢组学和微生物组学的迅速发展，新出现的证据表明，肠道微生物群和代谢物可能在IA的发病机制中发挥作用。然而IA破裂患者的肠道微生物群衍生代谢物的特征尚未见报道，因此在IA进展过程中这些微生物的明确功能和机制有待进一步阐明。
二、结果
1.研究队列的临床和人口学特征
宏基因组测序：纳入珠江医院的59名未破裂颅内动脉瘤（UIA）患者和50名破裂颅内动脉瘤（RIA）患者。非靶向代谢组学研究：珠江医院的30名UIA患者和30名RIA患者。靶向代谢组学研究：162名UIA患者和97名RIA患者，以此作为发现队列鉴定可能涉及颅内动脉瘤破裂的潜在肠道衍生代谢物。
临床特征(年龄、性别、身体质量指数(BMI)和吸烟情况)、并发症(包括心脏病、高胆固醇血症、中风史和糖尿病)和动脉瘤特征(包括多发性和平均直径)可以在每个组学研究中单独匹配。然而，在所有研究中，动脉瘤的不规则形状和位置都有显著差异，并且在靶向代谢组学研究中，RIA组的高血压患病率更高。
作者还招募了来自北京天坛医院的49例RIA患者和195例UIA患者作为验证队列来验证该生物标志物的有效性。结果显示，UIA组和RIA组在年龄、BMI和吸烟方面无显著差异。在高血压、心脏病、高胆固醇血症、中风和糖尿病患病率方面，两组间无显著差异。然而，UIA组和RIA组在性别上有显著差异(p=0.033)（图1）。
图1研究设计和工作流程
2.宏基因组数据显示了RIA组和UIA组肠道微生物群的分类特征
首先利用宏基因组测序分析，以评估破裂颅内动脉瘤（RIA）组和未破裂颅内动脉瘤（UIA）组的肠道菌群的分类学特征。从宏基因组数据中获得了1490种分类明确的微生物物种，并测试了两组之间的变化。对于α多样性指数，微生物群落的物种丰富度和均匀度没有显著差异（p>0.05）。对于β多样性，在Bray-Curtis距离中观察到肠道菌群的显著不同分布（Adonis检验p=0.01）。
与UIA组相比，我们发现RIA阶段的微生物组发生了变化。在RIA患者的粪便样本中，肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)和瘤状胃球菌 (Ruminococcus gnavus)的水平显著增加，而短双歧杆菌(Bifidobacterium breve) 、假链芽双歧杆菌(Bifidobacterium pseudocatenulatum)和糖化双歧杆菌(Fusicatenibacter saccharivorans)却明显减少。这些发现表明，RIA组和UIA组存在独特的肠道微生物群特征，这可能与IA特征和发育的差异有关（图2）。
图2：粪便宏基因组学分析揭示了不同阶段IA患者肠道微生物组成的改变
3.RIA组和UIA组具有代表性的KEGG通路和KO基因代谢酶反应公式
为了进一步确定RIA患者发生的微生物代谢过程，作者对KEGG orthology (KO)数据库中的微生物基因进行了注释，以重建和比较RIA和UIA样本的代谢途径。
研究发现色氨酸代谢功能模块在RIA样品中显著富集(p<0.05)。同时，与戊糖磷酸途径相关的基因在UIA相关的微生物组中显著富集(p<0.05)。根据代谢物和酶基因的反应的代表性公式，表明IS是值得研究变化的下游代谢物。利用基于基因组水平测序数据读取计数的HUMAnN3分析发现肺炎克雷伯菌是获取色氨酸酶基因的物种中贡献最大的物种。因此结果表明，RIA患者具有独特的微生物酶促反应和代谢过程（图3）。
图3：RIA组和UIA组具有代表性的KEGG通路和KO（KEGG orthology）基因代谢酶反应公式
4.非靶向代谢组学分析显示，发现队列的RIA组和UIA组之间的微生物组相关代谢物发生变化
鉴于微生物代谢基因功能的改变可引起宿主循环代谢物水平的变化，作者对30例RIA患者和30例UIA患者的血浆样本进行了非靶向代谢组学分析。采用正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)模型对RIA和UIA患者血浆样品代谢差异进行初步评价。结果显示，在正、负离子模式下，RIA组和UIA组血浆代谢物均有明显的分离。也就是说，在RIA患者与UIA患者的血浆中鉴定出52种差异表达的代谢物。热图显示了差异表达模式，表明在RIA患者中33种代谢物显著增加，主要包括氨基酸和吲哚化合物。而在UIA患者的19种代谢物水平（主要是胆汁酸）显著升高(图4)。
图4：非靶向代谢组学分析显示，与UIA相比，RIA患者的代谢活性发生变化
5.靶向代谢组学从发现队列和验证队列中证实在RIA组中显著富集的关键代谢物
为了进一步定量确认非靶向代谢组学发现的微生物相关代谢物的差异，作者对来自两个不同地理区域的参与者的血浆样本进行了靶向代谢组学研究，以评估两个队列中RIA和UIA患者的肠道微生物相关代谢物。结果显示，在两个中心的队列中，RIA组和UIA组的5种胆汁酸代谢物的水平始终存在显著差异。4种色氨酸代谢物，包括IS、5-羟色氨酸、尿色氨酸和色氨酸，在两个队列的RIA组中也有显著增加。最近的研究表明，IS对心血管有负面影响，这可能是RIA独特的代谢特征。
6.随机森林分析发现IA分层的潜在代谢生物标志物
用于发现IA进展的发病机制，作者建立了随机森林模型，探索能够区分RIA患者和UIA患者的代谢物组合。Gini分数平均下降反映了RIA和UIA患者血浆中代谢物的显著表达。与RIA相关的最高代谢物包括IS、5-羟色氨酸和犬尿氨酸，测试集的曲线下面积(AUC)为0.974，外部验证集的AUC为0.972。色氨酸代谢标志物的水平在两个队列中显示出一致的差异(图5)。
图5：随机森林模型对RIA和UIA代谢标志物的研究
7.RIA相关肠道菌群与循环代谢物之间的关系
为了进一步探索肠道微生物群与IA进展相关代谢物之间的关系，作者进行了Spearman相关分析，并对显著改变的分类特征、KEGG通路模块和关键代谢物进行了中介分析，以代表RIA和UIA的多组学特征。研究结果表明IS水平的升高与色氨酸代谢途径和肺炎克雷伯菌密切相关。因此，微生物KEGG通路和代谢物的改变与IA阶段微生物群的变化有关（图6）。
图6：整合宏基因组和代谢组分析揭示了RIA患者的分类群和代谢物之间的关联
8.体内实验验证肠道微生物群与小鼠血浆IS和IA的关系
为了验证肠道微生物群改变与血浆IS的相关性，对进行抗生素混合物（ABX）治疗的IA小鼠进行了IS水平检测。体内实验证实使用混合抗生素消耗小鼠肠道菌群可降低小鼠血浆IS水平，并降低IA的发生率与破裂率。而向混合抗生素处理的小鼠补充IS后，上述变化可得到逆转。这一变化可能是肠道微生物衍生的IS通过上调动脉瘤壁MMP9的表达促进弹性蛋白降解，进而加剧动脉瘤的形成与破裂（图7、图8）。
图7：IS增加了ABX治疗小鼠IA的形成和破裂
图8：肠道微生物组衍生的硫酸吲哚酚参与颅内动脉瘤的弹性蛋白降解。
三、结论
该研究全面表征了不同IA状态下的血浆代谢组学和肠道微生物组学。该结果为研究IA的发病机制提供了新的视角。该研究揭示了肠道微生物群衍生的色氨酸代谢物作为区分RIA和UIA患者的生物标志物的潜力，为IA的破裂风险判断提供了一种潜在的非侵入性的评估方法。同时，提出了肠道微生物群衍生的IS在IA壁弹性蛋白降解中发挥的作用，为IA的发病机制提供了新的见解。
此外，这项研究还强调了，需要进一步研究肠道微生物组衍生的组学特征与IA风险之间的潜在关联，这可能推动微生物组衍生策略的临床转化，以精确筛选和决策。
“肠脑轴双向通信”揭秘癌症的幕后玩家
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