![]()
![]()
第一作者：Di Deng, Zhihui Jiang, Lixin Kang
通讯作者：Binju Wang & Aitao Li
通讯单位：厦门大学，湖北大学
DOI：
https://doi.org/10.1038/s41929-024-01281-7
血红蛋白过氧化物酶是一类有吸引力的生物催化剂，能够利用H₂O₂将氧气掺入有机分子中。然而，由于外源性H₂O₂的使用会导致不可逆的氧化失活，它们的实际应用受到了阻碍。本文展示了一种在血红蛋白过氧化物酶中的替代催化途径，该途径使用O₂和抗坏血酸及脱氢抗坏血酸（DHA）等小分子还原剂来驱动反应。本文的实验和计算研究表明，DHAA（DHA的水合形式）作为关键共底物，能够激活氧气生成活性氧合铁卟啉化合物I。本文还证明了这种依赖O₂/还原剂的途径在不同血红蛋白过氧化物酶中的广泛适用性，突显了其对于单加氧酶功能的生物学意义。重要的是，这种创新途径避免了H₂O₂的使用，从而防止了不可逆的酶失活风险。最后，放大反应产生了具有优秀产率的手性增值产品，凸显出所开发的过氧化物酶技术在可持续化学转化中的合成潜力。图1| 含血红素的氧化酶生成Cpd I的不同催化途径1.在含血红素的过氧化物酶中，非特异性过氧化物酶（UPOs）因其能够利用过氧化氢（H2O2）作为氧化剂，将氧原子引入含有惰性C-H键的有机分子中而备受关注（图1a）。除了UPOs之外，某些细胞色素P450酶，如CYP152过氧化物酶（OleTJE、P450SPα和P450BSβ），也被归类为依赖H2O2的过氧化物酶。这些酶能够催化脂肪酸的羟基化或脱羧基反应，使用H2O2作为氧化剂（图1a）。与众所周知的需要还原伴侣（铁氧还蛋白和铁氧还蛋白还原酶）及还原剂NAD(P)H来激活分子氧的P450单加氧酶不同（图1b），UPOs和P450过氧化物酶都展现出更为简单的催化结构。它们可以直接从H2O2生成活性氧合铁卟啉复合物I（Cpd I）作为氧合物种（图1d），从而省去了复杂的电子传递链的需求。尽管UPOs和P450过氧化物酶作为选择性氧官能化催化剂具有明显优势，但它们与外源性H2O2进行的催化反应会遭受不可逆的氧化失活，这极大地限制了它们在选择性氧官能化化学中的工业应用。图2| rAaeUPO在小分子还原剂存在下对1a的羟基化作用1.为验证过氧化物酶（UPOs）能否利用O₂作为氧化反应的氧源，本文研究了来自Agrocybe
aegerita的众所周知的重组过氧化物酶rAaeUPO（PaDa-I变体，rAaeUPO）对乙苯（1a）的羟基化作用，在不同小分子还原剂的存在下进行（图2a,b）。结果表明，只有包含rAaeUPO、底物和抗坏血酸（AscA）的反应生成了期望的产物(R)-1-苯乙醇（1b）（图2c）。2.为进一步探究该反应是否为依赖O₂的过程，在无氧和有氧条件下进行了实验，观察到该反应在有氧条件下高效进行，而在无氧条件下则效率低下（图2d）。这表明由rAaeUPO催化的氧化反应依赖于AscA和O₂。此外，通过¹⁸O₂标记实验确认了氧化产物中的氧来源于¹⁸O₂（图2e）。最后，本文评估了rAaeUPO在AscA存在下对1a羟基化的催化性能。令人印象深刻的是，实现了高达632,100 ± 37,073的总转换数以及超过60 mM的产品浓度（图2f）。图3|确定DHA为rAaeUPO催化反应的实际共底物1.众所周知，抗坏血酸（AscA）可以在水溶液中顺利氧化形成脱氢抗坏血酸（DHA），然后DHA经水解产生2,3-二酮-L-古洛糖酸（DKG）。此外，DHA在水主要中以水合形式（DHAA）存在（图3a）。因此，本文推测进一步氧化产物（DHA或其水合形式DHAA，或DKG）可能作为实际的反应共底物。为了验证这一假设，本文比较了使用AscA、DHA或DKG作为还原剂时rAaeUPO的催化活性（初始反应速率）。结果表明，当存在DHA时，初始反应速率达到144 min−1，比使用AscA时快58%。而使用DKG时未检测到活性。这些发现倾向于支持这样的假设：DHA（或DHAA）可能是UPO催化氧化反应的实际共底物（图3b）。随后，实验在无氧和有氧条件下进行，并添加了DHA。与AscA的情况类似，只有在有氧条件下才实现了显著的催化活性（图3c），这表明DHA和O₂都是反应所必需的。图4| 在DHAA存在下，UPOs对O₂激活的机制研究1.为揭示DHA存在下UPO的催化机制，本文进行了大量的计算研究。值得注意的是，DHA之前被描述为一种较差的单电子还原剂，这与本文的计算结果一致。此外，DHA缺乏具有氧化还原活性的OH基团，这表明它可能不会作为O₂激活的还原剂。因此，DHA的水合半缩醛形式DHAA成为了一个潜在的候选者（图4a）。首先，密度泛函理论（DFT）计算表明，DHA水合生成DHAA是一个放热过程，ΔG为−2.4 kcal mol−1。这表明在水环境中DHA可能主要以水合形式存在，这与之前的发现相符。2.此外，分子动力学模拟显示，DHAA可以稳定地结合在UPO的活性位点上，其中DHAA通过与E196、R189和T192的氢键相互作用锚定在活性位点上（图4b）。这一观察结果进一步得到了分子力学（MM）/广义玻恩表面面积计算的支持，表明DHAA在UPO活性位点显示出高结合亲和力（ΔG = −27.9 kcal mol−1）。作为对比，本文也对对接的AscA进行了分子动力学模拟。然而，AscA未能稳定地结合在活性位点上，并在大约1 ns的模拟后脱离。基于这些发现，本文使用DHAA作为还原剂，进行UPO激活O₂的后续机理研究。图5| 确定GA和PA为rAaeUPO催化反应的共底物1.除了在新鲜植物组织中发现的DHA和AscA之外，本文假设在木质化组织中大量存在的多酚化合物也可能作为过氧化物酶（UPO）催化的氧化反应的潜在小分子还原剂。为了验证这一假设，分别研究了多酚化合物没食子酸（GA）和绿原酸（PA）在rAaeUPO催化的1a羟基化反应中的作用（图5a）。正如预期的那样，GA和PA作为共底物都表现出了优异的催化活性，其初始反应速率分别为265 min⁻¹和141 min⁻¹（图5b），这与使用DHA作为共底物时观察到的反应速率相当甚至更高。2.与之前的发现一致，我们发现对于GA和PA来说，反应只能在有氧条件下进行（图5b）。此外，添加UPO酶大大加速了GA和PA的消耗速率（图5c）。这些发现共同支持了GA和PA也可以作为UPO催化的氧化反应中的还原剂这一观点。图6| 使用不同还原剂时，UPO和P450过氧合酶催化的氧化反应1.为证明含血红素的过氧化物酶中O₂/还原剂依赖途径的普遍性，本文在另外五种代表性的过氧化物酶中研究了还原剂AscA、DHA、GA和PA。这些酶包括短型MroUPO（来自Marasmius
rotula），它参与环己烷的羟基化；CfuCPO（来自Caldarimyces
fumago），它介导苯甲基硫醚的亚砜化以及十二酸的β-羟基化或脱羧化，这三个反应由三种细胞色素P450过氧化物酶催化。如图6所示，以还原剂为燃料的UPO表现出比依赖H₂O₂的反应高得多的活性（图6a、b）。2.在对H₂O₂有相对较高耐受性的CfuCPO的情况下，只有DHA和GA相对于依赖H₂O₂的过程显示出催化性能的提高（图6c）。然而，对于P450SPα和P450BSβ催化的十二酸的α或β羟基化，所有以还原剂为燃料的反应都表现出比依赖H₂O₂的过程高得多的活性（图6c、e）。值得注意的是，GA和PA几乎达到了100%的底物转化率。然而，在P450OleTJE催化的脱羧反应中，大多数以还原剂为燃料的反应表现优于H₂O₂，尽管GA表现出相对较低的活性（但仍优于H₂O₂），这需要进一步研究（图6f）。因此，本文已经证明了O₂/还原剂依赖的催化途径在含血红素的过氧化物酶中的广泛应用可行性，展示了其优异的催化性能。我们提出，这种O₂/还原剂依赖的途径也可能适用于许多其他含血红素的酶。图7| rAaeUPO利用O₂/还原剂和H₂O₂依赖性过程将5a转化为5b图8|使用AscA作为还原剂制备高附加值产品的放大反应本文报道了一种在含血红素过氧化物酶中高效依赖O₂/还原剂的催化途径。在这种生物催化过程中，新鲜植物组织中存在的还原剂（如DHA或AscA），或木质化组织中丰富的多酚化合物（如GA或PA），可作为共底物引发氧化反应。对于UPOs与AscA或DHA的反应，实验和计算研究表明，DHAA是实际的共底物，负责激活氧气生成氧合铁卟啉（Cpd I）作为氧合物种。在此途径中，受控的Fe(III)–H₂O₂中间体在UPOs的整个催化循环的结合口袋中形成，这避免了过量H₂O₂的产生，从而减轻了血红素的破坏和随后的酶失活。与AscA或DHA不同，使用还原剂GA或PA会导致缓冲溶液中（酶口袋外）产生过量的H₂O₂，从而在一定程度上抑制了酶活性。有趣的是，本文发现这种发现的依赖O₂/还原剂的催化途径也适用于其他类型的含血红素过氧化物酶（包括短型UPOs、CPO和CYP152）。此外，本研究还表明，利用AscA/DHA作为还原系统的开发系统可以实现对易受H₂O₂氧化的底物的高效和选择性氧化，正如在槲皮素的生物转化中所证明的。综上所述，根据周围环境中O₂和外部电子供体（或小分子还原剂）的可用性，血红素过氧化物酶可以作为单加氧酶发挥作用。本研究团队预计，这种依赖O₂的途径将在未来生物催化以及脂肪酸的生理代谢、木质素降解和病原卵菌引起的植物感染中具有深远的影响。![]()
业务介绍
研理云，研之成理旗下专门针对科学计算领域的高性能计算解决方案提供者。我们提供服务器硬件销售与集群系统搭建与维护服务。 ● 配置多样（单台塔式、两台塔式、多台机架式），按需定制，质量可靠，性价比高。
● 目前已经为全国 100 多个课题组提供过服务器软硬件服务（可提供相同高校或临近高校往期案例咨询）。 ● 公司服务器应用工程师具有量子化学、第一性原理、分子动力学等相关学科研究背景。 ● 公司与多位化学、材料领域理论计算方向专家长期合作，一起探索最优服务器软硬件配置和部署。
● 定制化硬件配置：提供售前实例测试，为您提供最合适的硬件配置方案。 ● 一体化软件服务：根据需求，发货前，完成系统、环境、队列、计算软件等所有内容的安装与配置，让您实现开机即用。 ● 完善的售后服务：为每位客户建立专属服务群，遇到问题及时解决。大大降低使用学生使用门槛和缓解老师压力。三年硬件质保 + 三年免费软件技术支持。 ● 已购买客户咨询：我们已有超过100位已购买客户，可以给您提供相同城市或者临近城市已购买客户的联系方式，以提供真实案例咨询。 ● 赠送课程学习机会：可选课程包括量子化学（Gaussian），第一性原理，（Vasp），分子动力学模拟（Lammps、Grommacs），钙钛矿计算模拟（Vasp）等。具体赠送方案以沟通结果为准。
扫码添加客服微信
![]()
更多科研作图、软件使用、表征分析、SCI 写作、名师介绍等干货知识请进入后台自主查询。
