目前，基于单细胞测序技术开展畜禽等动物相关研究，涉及到生长发育、繁殖、营养与调控、感染与抗病，以及环境适应和动物医学模型等方向。以下解读的联川动物单细胞用户文章，是由浙江大学动物科学学院单体中教授团队近期发表在eLife杂志上：单核转录组测序揭示共轭亚油酸调节猪肌内脂肪沉积机制，涉及到营养和调控方向的研究论文，该研究范式非常经典，推荐读者参考借鉴！
共轭亚油酸(Conjugated linoleic acids，简称 CLAs)是人和动物不可缺少的一种亚油酸异构体。具有抗氧化、降低血清胆固醇、抑制脂肪积累、促进生长、刺激免疫等生物学作用，是一种新的保键功能脂质。肌内脂肪（IMF）沉积是与肉质性状和脂肪营养价值呈正相关的关键因素，CLAs能够调节骨骼肌的质量和脂肪浸润，但其具体的细胞学机制尚不清楚。
近期，浙江大学动物科学学院单体中教授团队在eLife（IF=6.4）杂志发表题目为“Single-nucleus transcriptomics reveal the cytological mechanism of conjugated linoleic acids in regulating intramuscular fat deposition”的研究论文，该研究应用单核RNA测序（snRNA-seq）基于猪模型来表征CLAs调节骨骼肌脂肪浸润的细胞学机制，揭示了CLAs对猪肌肉细胞群和分子特征的调控作用，发现CLAs可以促进快速糖酵解肌纤维向慢氧化肌纤维的转化。这项研究为利用营养策略调节骨骼肌中的脂肪浸润提供了基础，并为将猪作为研究人类脂肪浸润性疾病的动物模型提供了潜在的机会。
单体中教授团队以往的研究揭示了莱芜猪骨骼肌中脂质沉积的细胞异质性和转录动力学（Wang L, et al., 2023），详见单细胞用户文章揭示猪肉中脂质沉积的细胞动力学和转录机制|单细胞多组学
l 样本类型：猪背最长肌（LDM）
l 分组信息：CLAs给药组和未给药组（CLA组和CON组）
l 单细胞平台：10x Genomics，snRNA-seq（通过联川流式细胞仪FACS分选去除碎片杂质纯化细胞核悬液）
图 CON和CLA猪肌肉单核转录组测序流程
1、snRNA-seq鉴定了黑盖猪背最长肌（LDM）8种不同的细胞类群，CLAs改变了细胞的比率和转录动态；
2、详细分析了肌纤维细胞的特征，鉴定了6种不同的肌纤维细胞亚型，CLAs改变肌纤维亚型的比率，功能分析揭示CLAs可以促进快速糖酵解肌纤维向慢氧化肌纤维的转化；
3、详细分析了脂肪细胞的特征，鉴定了3种不同的脂肪细胞亚型，CLAs改变脂肪细胞亚型的比率，伪时序分析揭示3种亚型的分化轨迹；
4、基于以往数据（高肌内脂莱芜猪模型LDM的snRNA-seq）的伪时序分析验证了上述脂肪细胞亚型的分化轨迹；
5、细胞-细胞通信分析揭示脂肪细胞与其他细胞，尤其是成脂祖细胞/成纤维细胞之间存在强烈的相互作用，采用莱芜猪模型分析得到同样的结论；
6、详细分析了成脂祖细胞（FAPs）/成纤维细胞的特征，鉴定了3种不同的细胞亚型，伪时序分析和体外分化实验证实，CLAs影响了FAPs向成熟脂肪细胞或成纤维细胞的分化方向；
7、差异基因&通路分析，以及体外JNK激活实验揭示了CLAs影响FAPs分化的机制：CLAs通过抑制JNK信号通路促进FAPs定向分化为SCD+/DGAT2 +脂肪亚型。
以往的研究发现CLAs提升黑盖猪LDM中的肌内脂肪（IMF）含量（Wang L, et al.，2022），本次研究也发现CLAs显著增加了猪LDM中的甘油三脂（TG）含量，但显著降低了总胆固醇（TC）含量(图1A )。同时，免疫荧光染色结果显示CLAs组的LDM中脂滴增多(图1B )。
为了在细胞水平上研究CLAs处理后猪肌肉细胞异质性的变化，本研究应用10x Genomics平台对黑盖猪的LDM组织进行snRNA-seq(图1C )。利用细胞特异性marker基因的表达情况进行细胞鉴定，两组猪肌肉中鉴定了8种不同的细胞类群：包括肌纤维（CAPN3）、成脂祖细胞/成纤维细胞（PDGFRA）、内皮细胞（CD34）、脂肪细胞（PPARG）、免疫细胞（PTPRC）、肌肉卫星细胞（PAX7）、髓源性细胞（MRC1）和周细胞（RGS5）(图1E )。这些细胞类群在两组中的占比中显示了差异(图1F )，与CON组相比，成脂祖细胞/成纤维细胞（3.39% vs 8.31%）、内皮细胞（1.26% vs 2.94%）、脂肪细胞（1.74% vs 2.37%）、髓系来源细胞（0.93% vs 2.17%）和周细胞（0.45% vs 0.7%）在CLA组中的比例更高。然而，CLAs降低了肌纤维的比例（90.46% vs 81.1%）。热图显示了8种不同细胞类群差异表达最显著的前10个基因（DEGs），DEGs富集的KEGG通路情况(图1G )。这些结果表明，黑盖猪在喂食CLAs后，LDM的细胞类型存在显著差异，这可能是导致脂质沉积改变的因素。
图1 CON和CLA猪肌肉snRNA-seq分析
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为了探讨CLAs处理后肌纤维的变化，作者对肌纤维细胞群进行了亚聚类分析(图2A )，鉴定了6种不同的肌纤维细胞亚型，包括I型肌纤维（MYH7）、IIA型肌纤维（MYH2）、IIX型肌纤维（MYH1）、IIB型肌纤维（MYH4）、肌腱连接细胞：NMJ（ANKRD1）和神经肌肉连接：NMJ（ABLIM2）(图2B )。
条形图显示I型肌纤维（17.54% vs 22.01%）和IIA型肌纤维（3.64% vs 7.52%）的比例在CLA组有增加的趋势，而IIX型肌纤维（10.09% vs 3.87%），IIB型肌纤维（63.88% vs 59.35%），MTJ（6.41% vs 0.28%）和NMJ（5.32% vs 0.09%）的比率在CLA组有下降的趋势(图2C )。此外，小提琴图显示CLAs增加了肌纤维型标记基因（MYH7、MYH2、MYH1和MYH4）、肌纤维型转化相关基因（PPARGC1A、STK11和HDAC1）和氧化相关基因（COX5A、COX5B和COX8A）的表达，但降低了糖酵解相关基因(PFKM、HK2和LDHC）的表达（图2D )。热图显示6种肌纤维细胞亚型之间的TOP10 DEG（图2F )，功能富集分析显示，I型肌纤维中的代谢途径、氧化磷酸化和产热作用，以及IIB型肌纤维中的钙信号通路、cGMP-PKG和MAPK信号通路显著富集(图2G )。这些结果表明，两组肌纤维存在显著的异质性，CLAs可以促进快速糖酵解肌纤维向慢氧化肌纤维的转化。
图2 肌纤维的亚型分析
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为了研究CLAs在IMF沉积中的调控机制，作者对脂肪细胞进行了亚聚类分析，脂肪细胞分成了3个亚型：包括SCD + /DGAT2 +脂肪细胞、FABP5+/SIAH1+脂肪细胞和PDE4D + /PDE7B +脂肪细胞(图3A)。CLAs增加了SCD + /DGAT2 +脂肪细胞的数量和比率（79.37% vs 82.31%）(图3B)，但PDE4D + /PDE7B +脂肪细胞比例降低（14.81% vs 11.19%）。研究还发现，CLAs增加了SCD + /DGAT2 +脂肪细胞标记基因（SCD和ARHGAP31）和FABP5 + /SIAH1 +脂肪细胞标记基因（SIAH1和COX1）的表达，但降低了PDE4D + /PDE7B +脂肪细胞标记基因（PDE4D）的表达(图3C )。免疫荧光结果显示，CLA组的LDM中有更多的SCD1 +脂肪细胞(图3E )。热图中显示了3个亚型TOP10 DEGs和KEGG富集情况(图3F )。
为了探讨CLAs对脂肪细胞分化轨迹的影响，作者对脂肪细胞进行了RNA速度分析。RNA速度结果显示PDE4D + /PDE7B +脂肪细胞和FABP5 + /SIAH1 +脂肪细胞可分化为SCD + /DGAT2 +脂肪细胞(图3H )，解释了CLAs增加SCD + /DGAT2 +脂肪细胞数量的原因。
图3 脂肪细胞的亚型分析
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为了进一步验证脂肪细胞的分化轨迹，作者采用以往研究的数据进行验证分析（高/低肌内脂莱芜猪模型的snRNA-seq，Wang L, et al., 2023）。在莱芜猪的脂肪细胞中，高肌内脂（HLW）组的SCD + /DGAT2 +脂肪细胞比例高，而PDE4D + /PDE7B +脂肪细胞比例低(图4B )。免疫荧光结果显示，HLW组的SCD1 +脂肪细胞较多(图4C )。伪时间轨迹和RNA速度分析证实，PDE4D + /PDE7B +亚簇可以在SCD + /DGAT2 +和FABP5 + /SIAH1 +亚簇两个不同的方向上分化(图4D-F )。因此，肌肉中成熟脂肪细胞的分化轨迹如图4H显示，PDE4D + /PDE7B +脂肪细胞可分化为SCD + /DGAT2 +和FABP5 + /SIAH1 +脂肪细胞，FABP5 + /SIAH1 +脂肪细胞也可分化为SCD + /DGAT2 +脂肪细胞。此外，在HLW组中，SCD、DGAT2、FABP5和SIAH1的表达上调，而PDE4D和PDE7B的表达下调(图4I )。这些结果与上述黑盖猪脂肪细胞亚型的分化轨迹相互印证。
图4 高肌内脂莱芜猪模型脂肪细胞的拟分化分析
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为了进一步探究脂肪细胞与其他细胞簇之间的关系，作者使用CellPhoneDB对黑盖猪肌肉8种细胞类型进行了细胞间通信分析，发现脂肪细胞主要与内皮细胞、成脂祖细胞/成纤维细胞、肌肉卫星细胞和周细胞相互作用(图5A )。受体配体相关作用点图显示，脂肪细胞与其他细胞通过LRP6、FGFR1和COL4A2等通路进行更强的通讯(图5C )。
此外，作者还对以往研究的数据（高/低肌内脂莱芜猪模型的snRNA-seq，Wang L, et al., 2023）莱芜猪肌肉的9种细胞类型进行了细胞间的通信分析，发现脂肪细胞主要与侧群细胞（SPs）、成脂祖细胞/成纤维细胞、内皮和周细胞相互作用(图5B )。此外，受体配体相关作用点图显示，在莱芜猪的LDM中，脂肪细胞通过COL6A3、LAMC1和THBS1通路与其他亚群的通信更强（图5D )。这些结果表明，脂肪细胞与成脂祖细胞/成纤维细胞存在非常密切的相互作用。
图5 脂肪细胞与其他细胞间的通讯分析
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以往的研究表明，FAPs可以分化为成熟的脂肪细胞，是IMF的主要细胞来源（Joe AW, et al., 2010；Uezumi A, et al., 2010）。为了进一步研究CLAs对IMF沉积发生机制的影响，作者对FAPs/成纤维细胞进行了亚聚类和假时间轨迹分析。鉴定了3个亚群，包括FAPs（PDGFRA）、成纤维细胞（COL1A1）和PDE4D + /PDE7B +亚群（PDE4D和PDE7B）(图6B )。在CLA组中，FAPs比例（70.40% vs 37.06%）和PDE4D+/PDPDE7B+亚群比率（4.11% vs 2.18%）高于CON组，但成纤维细胞比例(60.76% vs 25.49%)则较低(图6C )。为了进一步探索FAPs的分化轨迹，作者对FAPs/成纤维细胞进行了RNA速度分析。结果表明，FAPs可以分化为PDE4D + /PDE7B +和成纤维细胞亚群(图6E)。
分离猪原代FAPs进行体外成脂分化实验，在这过程中显示FABP4、ADIPOQ、SCD和DGAT2的表达显著增加，而PDE4D的表达显著下调。此外，在成脂分化过程中，FABP5和SIAH1的表达先显著升高后显著降低(图6G )。FAPs可能首先分化为PDE4D + /PDE7B +前体脂肪细胞，然后分化为PDE4D + /PDE7B +肪细胞(图6H )。这些结果表明，猪肌肉中FAPs向成熟脂肪细胞的分化轨迹受到CLAs的影响，进而影响IMF的沉积。
图6 FAPs的分化轨迹分析
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为了进一步探讨CLAs调控IMF沉积的机制，作者接下来研究了CLAs对FAPs向脂肪细胞分化轨迹的调控作用。从仔猪中分离了初级FAPs并诱导成脂分化。Nile Red染色和OD490结果显示，在体外成脂分化8天后CLAs可促进FAPs的成脂分化（图7A-B )。此外，SCD、SIAH1和成脂基因FABP4、PPARG、FASN的表达水平均显著增加，但PDE4D显著下调(图7C-D )。通路分析发现MAPK信号通路在脂肪细胞中富集，特别是SCD + /DGAT2 +亚簇(图7E )。MAPK信号通路包括ERK、JNK和p38相关基因的表达发生改变（图7F)。值得注意的是，JNK磷酸化蛋白水平显著降低(图7G )。
因此，接下来使用JNK激活剂来探索其调控机制(图7H )。油红染色显示，经过24h激活剂处理后，CLAs对FAPs的成脂分化被显著抑制(图7I )，与CLA组相比，CLAs+激活剂组的OD 490值低于CLAs组(图7J )。Nile Red染色结果也显示，激活剂显著抑制了CLAs处理后FAPs中脂滴的数量(图7K )。经激活剂处理后，MAP2K4表达显著上调，FABP4和SCD的表达显著降低(图7L )。这些数据表明，CLAs可能通过抑制JNK信号通路促进FAPs定向分化为SCD+/DGAT2 +脂肪亚型。
图7 CLAs调控FAPs分化的机制研究
本研究基于猪模型通过snRNA-seq对CLAs调节骨骼肌脂肪浸润的细胞学机制提供了详细的见解，研究分析了CLAs对猪肌肉细胞异质性和转录动力学的影响，发现CLAs可以通过调节PGC1α促进糖酵解肌纤维类型向氧化肌纤维类型转变。研究还确定了FAPs和脂肪细胞的分化轨迹，CLAs可以通过抑制JNK信号通路促进FAPs向DGAT2 + /SCD +脂肪细胞分化。本研究为开发肌骨病和其他肌肉相关的营养策略提供了一种新的途径。
1. Wang L, et al. Single-nucleus transcriptomics reveal the cytological mechanism of conjugated linoleic acids in regulating intramuscular fat. eLife. 2024 Jul 17;13:RP99790. https://doi.org/10.7554/eLife.99790.1
2. Wang L, et al. CLA improves the lipo-nutritional quality of pork and regulates the gut microbiota in Heigai pigs. Food Funct. 2022 Nov 28;13(23):12093-12104.
3. Wang L, et al. Single-nucleus and bulk RNA sequencing reveal cellular and transcriptional mechanisms underlying lipid dynamics in high marbled pork. NPJ Sci Food. 2023 Jun 2;7(1):23.
4. Joe AW, et al. Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis. Nat Cell Biol. 2010 Feb;12(2):153-63.
5. Uezumi A, et al. Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle. Nat Cell Biol. 2010 Feb;12(2):143-52.
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