Olink+Bulk TCR|共同揭示bintrafusp alfa治疗HPV相关恶性肿瘤患者临床免疫特征

大多数实体瘤患者例如人乳头瘤病毒(HPV)相关恶性肿瘤患者的转移性病变肿瘤活检通常难以获得，并且活检组织只能确定肿瘤演变的一个或有限个时间点，无法动态监测患者的实时状态。

Bintrafusp alfa是一种可以靶向PD-L1和TGFβRⅡ的双功能抗体蛋白，Ⅰ/Ⅱ期临床试验发现其在人类乳头瘤病毒 (HPV) 相关肿瘤中具有临床活性。本文从不同的层面，研究bintrafusp alfa治疗之前及早期的患者，对HPV相关癌症患者外周血免疫特征的各个方面进行调查，以更好地了解该药物的作用模式，并帮助确定哪些患者更有可能从Bintrafusp alfa治疗中获益。

美国国家癌症研究所肿瘤免疫与生物医学实验室Jeffrey Schlom博士团队近期在Journal for ImmunoTherapy of Cancer杂志上发表题为“Immune correlates of clinical parameters in patients with HPV-associated malignancies treated with bintrafusp alfa”的文章。

研究对象：入组65例HPV相关的恶性肿瘤，其中43例既往未接受过免疫治疗 (ICI naïve)，22例接受免疫治疗后进展 (ICI难治性)，包括宫颈癌（n=28）、头颈鳞癌（H&N，n=18）、肛门癌（n=10）和HPV相关罕见肿瘤（n=9）；

检测样本：血液

采样时间：基线，治疗后2周 (1个周期)，治疗后6周 (3个周期)；

研究方法：Olink（Immuno-Oncology）、TCR分析、全血细胞计数、流式细胞术

不同类型hpv相关癌症患者免疫谱的差异

研究评估了bintrafusp治疗HPV相关癌症患者的外周免疫效果，包括宫颈癌(n=28)、H&N (n=18)、肛门癌(n=10)和罕见癌(n=9)。首先评估了宫颈癌患者与H&N癌症患者的免疫谱是否存在差异，(1)与H&N癌患者相比，宫颈癌患者血浆中IL- 12、CXCL5和MCP3水平较高(图A)，(2)绝对淋巴细胞计数(ALC)较高(图B)， (3) naïve CD8+ T细胞和CD8+ T细胞表达CD73(图C)的频率更高，然而在免疫细胞亚群的主要分组、其他免疫细胞亚群(n=158)或其他血浆蛋白的Olink分析中，没有显著差异。因此，在随后的研究中，不同HPV相关癌症的患者被一起分析。

ICI naïve与ICI难治性患者免疫谱的差异

接下来研究人员评估了未接受过既往ICI (ICI naïve)的HPV相关癌症患者与接受过ICI治疗并进展的患者(ICI难治性)的免疫谱是否存在差异。与ICI naïve患者相比，ICI难治性患者血浆中sPD- 1、sCD73和sCTLA4水平显著升高，这些均与免疫抑制有关;在ICI难治性患者中也发现了较低水平的sCD27:sCD40L，这表明免疫激活。ICI naïve与ICI 难治性HPV相关肿瘤患者中基于Olink的外周细胞因子差异分析，发现难治性患者中有9个细胞因子表达升高（PDCD1、PDL1、FGF2、CXCL9、CXCL10、CCL20、NOS3、MMP12 和 MUC16）；无监督聚类分析显示这9个细胞因子可以区分ICI naïve和难治性患者（图B）。

Bintrafusp alfa 治疗可以影响患者的外周免疫特征

Bintrafusp alfa治疗1个周期后：免疫抑制细胞因子TGFβ1显著降低，且持续整个给药周期；sPD-1、sCTLA4、sCD73、sCD27水平及sCD27：sCD40L比值升高，除sCD73外，3个周期后这些分析物仍持续高于基线水平。

Bintrafusp alfa三个治疗周期后：免疫抑制细胞因子IL-8增加，治疗后CBC也发生变化：白细胞计数 (WBC)、ANC、NLR 和绝对单核细胞计数 (AMC) 在一个和三个周期的治疗后均增加；CD8+T细胞 （1个周期后）、CD4+T细胞（3个周期后）和 NK-T细胞（1个和3个周期后）减少。 

Bintrafusp alfa治疗与外周免疫特征的关系——Olink

研究人员根据治疗反应将患者分为两组：最佳总临床反应( BOR) 为 CR、PR、MR或至少4个月SD的患者作为反应组（R组）；BOR 为 PD的作为无反应组（NR组）。1、使用 Olink Immuno-Oncology panel对 92 种蛋白分析指标进行评估，发现了12种蛋白在R组含量较低（CD40L、FGF2、HGF、IL-6、TGFβ1、TNFSF14、NOS3、CXCL1、CXCL5、IL-7、MUC16 和 PTN），无监督聚类分析发现大多数R组聚集在一起保持较高一致性，与NR组分开。

2、通过可溶性因子等检出发现R组具有较低水平的抑制因子TGFβ1和可溶性CD73包括更高的sCD27:sCD40L比值，这些指标都与免疫抑制相关联。R组相比NR组在治疗前具有更高的免疫激活水平基线免疫状态与bintrafusp alfa治疗反应相关

Bintrafusp alfa治疗与外周免疫特征的关系——免疫细胞

1、基线处R组和NR组的免疫细胞亚群也有显著差异。R组患者的 MDSCs和单核细胞水平较低，而CD8+T细胞:MDSCs（髓系抑制细胞）的比率较高。治疗前，R组与免疫激活相关的细胞含量较高，初始CD4+和CD8+T细胞以及免疫抑制相关的免疫细胞水平显著降低。

2、在治疗之前，应答者也有更高水平的特异性PBMC亚群，表明免疫激活增强，包括效应记忆CD4+ T细胞和表达CD4+ T细胞、CD8+ T细胞和NK细胞的PD- 1。显著降低naïve CD4+和CD8+ T细胞，以及指示免疫抑制的免疫亚群，如CD73+CD8+ T细胞和PD- L1表达水平。

Bintrafusp alfa治疗与外周免疫特征的关系——TCR分析

在基线时，研究选择n=12 (n=6 NR, n=6 R)的外周血冻存样品检出TCR多样性。通过25%的reads中看有多少种克隆种类评判TCR的多样性，其中5/6应答者(83%)vs 2/6(33%)无应答者TCR克隆少于400个。R组显示出更高的克隆增殖，在基线时免疫的激活状态更好。

PS：完全缓解或部分缓解的BOR患者用红色表示

Bintrafusp alfa诱导的早期免疫特征变化与治疗临床反应相关

Bintrafusp alfa治疗一个周期后，与NR组相比，R组患者的IL-8降低、ALC升高、 ANC和 NLR降低。三个治疗周期后，IL-8、ANC和NLR的差异持续存在。

构建预测 HPV 相关癌症患者对 bintrafusp alfa 反应的模型

在HPV相关癌症患者中，研究人员首先使用血浆分析物和CBC参数进行logistic回归分析，其中58例患者在基线和使用bintrafusp治疗后2周时间点的数据。本研究将CR、PR、MR或SD >4个月的BOR患者与PD的BOR患者进行比较，并将患者分为训练组(n=43)和测试组(n=15)。使用基线tgf - β1的对数转换水平和治疗2周后IL- 8和NLR的百分比变化，在训练集中建立的3因素模型产生的ROC曲线产生的总体X2为23.93,AUC为0.892。该模型用于计算个体患者的应答概率。使用截断值为0.5，该模型可以预测临床反应，训练集的准确率为84%，测试集的准确率为80%，训练集和测试集的准确率为83%。

利用治疗前的外周免疫特征进行建模

研究人员还开发了第二种模型，仅在基线时使用血浆蛋白因子和CBC数据，其中数据来自63例患者。在这里，将总生存期>180天的患者与总生存期<180天的患者进行比较，并将患者分为训练集(n=42)和测试集(n=21)。使用基线TGF-β1、IL- 8和NLR的对数转换水平在训练集中建立的三因素模型生成的ROC曲线产生的整体X2为16.32,AUC为0.841。该模型用于计算个体患者的应答概率。该模型可以预测≥180天的总生存期，训练集的准确率为76%，测试集的准确率为91%，训练集和测试集的准确率为81%。

文章讨论了bintrafusp alfa的多种作用模式，包括减少TME中的TGFβ信号、降低调节性T细胞的免疫抑制活性、增加肿瘤细胞表型的改变等。研究还提供了对ICI naïve与ICI难治性患者外周免疫组差异的信息并为通过分析HPV相关恶性肿瘤患者的细胞、蛋白及可溶性组分，构建了两个筛选bintrafusp alfa 反应的模型，准确率大于80%。用于很多晚期肿瘤患者无法获得肿瘤组织标本，难以进行基于组织的人群筛选和药物机制研究。这些结论为HPV相关恶性肿瘤的免疫治疗提供了新的见解，并可能有助于开发更有效的个性化治疗策略。

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