单细胞+BuIKTCR|时序单细胞追踪揭示肺癌抗PD-1治疗期间前体耗竭T细胞的克隆复兴及扩增

抗PD-1治疗在非小细胞肺癌 (NSCLC) 治疗中已显示出前所未有的临床成功，但其潜在机制仍未完全了解。本项研究通过对36名接受PD-1治疗的NSCLC患者的47个肿瘤活检样本进行了scRNA seq和配对T细胞受体测序。作者观察到在治疗后的反应性肿瘤中，耗竭T细胞前体（Texp）细胞水平增加，其特征是共抑制分子低表达和GZMK高表达。相比之下，无反应性肿瘤未能积累到Texp细胞。相关数据表明，Texp细胞不太可能来自最终耗尽的细胞的重新激活；相反，它们是通过局部扩增和由带有新克隆型和已有克隆型的外周T细胞补充而积累的，并将这种现象称为克隆复兴。随着研究的深入了解了基于PD-1的疗法背后的机制，并表明Texp细胞的克隆复兴和扩增是改善NSCLC治疗的步骤，从而更好的说明PD-1相关治疗的基础原理。

首先研究人员对对 36 名 NSCLC 患者的一组 47 个肿瘤活检样本采用scRNA-seq和配对T细胞受体 （scTCR-seq）测序并进行了分析，涵盖了33个未接受过治疗的样本、9个部位匹配的治疗后有反应的样本（来自8个肿瘤）和5个治疗后无反应的肿瘤标本，这些标本均接受了抗PD-1与化疗的联合治疗。经分析，在CD4 ⁺ T细胞中作者发现反应性肿瘤在治疗后FOXP3 ⁺调节性T细胞 (Treg) 略有减少，而治疗后无反应的肿瘤样本，此类细胞是显着增加的。

图1

接下来研究人员进一步对Treg进行了差异表达分析，结果发现与治疗后有反应的肿瘤相比，治疗前和无反应的肿瘤中与免疫抑制功能相关的基因（IL1R2、REL和LAYN）显著富集。除此之外，4-1BB⁺Tregs的表达也是显著提高的。这与之前的研究一致，研究称4-1BB ⁺ Treg可能和非小细胞腺癌患者的预后不良相关。

图2

接着评估了浸润的CD8 ⁺ T细胞，通过对剩余的肿瘤活检进行免疫组化（IHC）染色，并观察到scRNA-seq和染色数据之间CD8 ⁺ T细胞比例的显著相关性。研究发现CD8⁺T细胞在对治疗有应答的肿瘤中高度富集，并确定了三大细胞群——终端Tex、非耗竭和增殖性CD8 ⁺ T细胞，其中衰竭特征基因，包括 PDCD1、CTLA4 和 HAVCR2，在终末耗竭T细胞中高表达。

图3

作者进一步检查了三个之前发表的肿瘤特异CD8 ⁺ T细胞数据集，发现耗竭T相关的标志基因都显示出高度表达，且这些基因均在经过治疗的应答患者中的终末Tex子集中富集。先前的研究表明在慢性病毒感染期间，PD-1通路阻断可以在一定程度上改善终末Tex亚群的效应功能。为了确定这种现象是否可以在人类肺癌中观察到，通过GSEA分析发现在反应性肿瘤中治疗后，终末Tex亚群中此类基因显著富集，表明它们在治疗后效应功能得到改善。

图4

接着研究发现除了终端和增殖性 Tex 细胞之外，还确定了两种与终端Tex亚群共享TCR的非耗竭细胞状态 GZMK ⁺ NR4A2 ^-和GZMK ⁺ NR4A2 ⁺ T细胞，且这两个集群都显示出共抑制分子的表达减少和GZMK的表达增加。

图5

接着作者对驻留记忆和循环T细胞特征的分析揭示了从GZMK ⁺ NR4A2 ^-到GZMK ⁺ NR4A2 ⁺细胞，再到终端Tex细胞的组织驻留表型增加，而循环表型显示出相反的模式。这种潜在的分化轨迹得到了相关RNA速率分析的进一步支持，尽管还需要额外的功能验证。最终使用基于 TCR 的选择方法发现，GZMK ⁺ NR4A2 ^–、GZMK ⁺ NR4A2 ⁺、终末和增殖性Tex细胞是人类肺癌肿瘤中存在的四种转录上不同的Tex细胞群。为清楚起见，GZMK ⁺NR4A2 ^–/+亚群在此被称为Texp1 ( GZMK ⁺ NR4A2 ^– ) 和 Texp2 ( GZMK ⁺ NR4A2 ⁺ ) 细胞。

图6

当将Tex（终端Tex和Texp）细胞与不与CD8 ⁺ T细胞（Tex无关细胞）进行比较时，我们发现CXCL13在终端Tex和Texp 细胞中高度且专门地表达。Tex细胞产生的CXCL13可以介导免疫细胞向肿瘤的募集，并且可能是三级淋巴结构形成的驱动因素之一。研究还分析了治疗前后Texp细胞中CXCL13的表达，发现与治疗前相比，CXCL13仅在治疗后Texp细胞中高度表达，并进行了验证分析。

图7

作者接下来通过对14个治疗后肿瘤样本中和13个来自原发性肺肿瘤（n = 7）或淋巴结转移的样本研究了治疗期间Texp 细胞的丰度如何变化。研究观察到治疗前肿瘤中的大多数Tex细胞处于终末衰竭状态，而治疗后Tex细胞中大量富集了Texp细胞。还对反应性肿瘤中每个显性Tex克隆的进一步差异表达分析表明，与治疗前相比，治疗后的Tex细胞始终表达较低水平的衰竭基因，支持Texp细胞对治疗的反应增加。接下来，作者重点分析了治疗后无反应的肿瘤以及其余的未接受治疗的肿瘤。与治疗前有反应的样本一样，这些肿瘤未能积累Texp细胞，其中终端Tex亚群占主要比例。以上结果发现耗竭性T细胞的扩增水平明显高于非耗竭性T细胞，支持了肿瘤的特异性克隆扩增。此外，对非耗竭性T细胞的进一步分析显示，这些亚群在治疗后并没有表现出持续较高的克隆扩增。这些结果提示耗竭性T细胞亚群可能是先前报道的对PD-1治疗有反应的主要细胞类型。

图8

接着作者评估了预先存在的Texp细胞是否会因治疗而扩增，研究表明可以在治疗前的肿瘤中发现大部分治疗后的Tex克隆表型，相当于治疗后Tex细胞的62.2%。此外，这种重新出现的（预先存在的）克隆型显著富集于大尺寸，表明它们在肿瘤抗原识别和进一步的抗肿瘤活性中起主要作用。

图9

为了进一步研究 Texp 细胞是否可以从外周补充，作者对四个反应样本的治疗前和治疗后血液样本进行了批量TCR-seq 分析，研究发现在肿瘤组织中扩增的克隆型也可以在血液中检测到。此外通过拓展分析，将肿瘤中所有共享的克隆型与血液中的克隆型进行匹配，并观察到克隆大小的普遍和显著相关性，发现外周T细胞可以作为肿瘤内T细胞池提供。值得注意的是，大多数新的Tex克隆型 (87%) 仅在治疗后血液中检测到，支持治疗后具有新的肿瘤抗原特异性的新克隆的激活。

 图10

尽管外周T细胞和肿瘤内T细胞共享TCR，但Texp细胞迁移的方向尚不清楚。因此作者对P019治疗后剩余的冷冻血液样本进行了配对scRNA-seq和scTCR-seq，且采样时间点与治疗后肿瘤活检的时间点相同。结果确定了特定的外周血 CD8⁺T细胞与瘤内耗竭性T细胞共享的相同TCR。

图11

这篇文章通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）和T细胞受体（TCR）测序技术，研究了非小细胞肺癌（NSCLC）患者在抗PD-1治疗期间肿瘤微环境中T细胞的动态变化。

1.T细胞克隆型追踪：通过Bulk TCR测序，研究者能够追踪治疗前后肿瘤组织中T细胞克隆型的变化。这有助于理解抗PD-1治疗如何影响肿瘤特异性T细胞群体。

2.治疗前后T细胞克隆型的比较：研究者发现，在治疗响应的肿瘤中，治疗后出现了新的T细胞克隆型，这些新克隆型在治疗前未被检测到。这表明抗PD-1治疗可能促进了新的肿瘤特异性T细胞克隆型的产生。

3.T细胞克隆型在肿瘤和血液中的分布：通过比较肿瘤组织和外周血中的T细胞克隆型，研究者发现某些在肿瘤中扩增的克隆型也能在血液中被检测到。这支持了外周T细胞可能作为肿瘤内T细胞库的观点。

4.克隆性复兴（Clonal revival）：研究中提出了“克隆性复兴”的概念，指的是治疗后，既有新的T细胞克隆型产生，也有治疗前已存在的T细胞克隆型在治疗后得到复兴和扩增。

5.治疗响应与T细胞克隆型的关系：研究者观察到，治疗响应的肿瘤中，T细胞克隆型的多样性和数量有所增加，这可能与治疗后肿瘤微环境中免疫反应的增强有关。

6.不同癌症类型的T细胞动态：研究还涉及了其他癌症类型（如基底细胞癌、鳞状细胞癌和黑色素瘤）的数据，发现不同癌症类型中T细胞克隆型对免疫检查点阻断治疗的反应可能存在差异。

这些结论强调了T细胞克隆型在抗PD-1治疗中的重要性，并为未来的治疗策略提供了潜在的生物标志物和治疗靶点。

 免疫组库测序（IR-SEQ）：BCR/TCR分子结构及多样性

用户文章：m6A和组蛋白乳酸化2大表观热点搭配铁死亡冲击10分+文章

动物营养调控单细胞测序怎么研究？这篇eLife用户文章值得参考 | 农学单细胞专题

还在玩单细胞图谱？何不试试单细胞+表观组学的神仙组合！强烈推荐收藏！

本文系联川生物公众号原创文章，未经授权禁止转载，侵权必究！

扫描下方二维码