15年前，现任北京大学生命科学学院BIOPIC中心教授，汤富酬教授，在Nature Methods上发布了一项高灵敏度mRNA单细胞测序技术，这一年也被公认为单细胞测序技术诞生的一年[1]。该技术提供了在单个细胞层面上解析细胞异质性和复杂生物学过程的能力，从而极大地推进了我们对疾病机理、细胞功能和生物发育的理解。
5年前，芝加哥大学赵英明教授课题组发现了一种新的翻译后修饰（PTM）——组蛋白乳酸化（histone lactylation），该发现一经发表就登上了Nature[2]。时至今日这一概念被迅速研究报道，已然成为表观研究的新宠，国自然的黑马，顶刊的常客......。组蛋白乳酸化的背景知识、检测方法以及研究思路，小编已在之前的推文中做了比较全面的介绍，如想先行了解，欢迎点击：“一文带你快速了解表观修饰“当红炸子鸡”——「组蛋白乳酸化」研究”。
而发展至今，已被大家所熟知的单细胞转录组测序技术遇到新晋热点组蛋白乳酸化修饰，又会使我们在疾病研究当中有怎样的新发现呢？下面我们就一起来看下这篇经典案例，同时也希望这类新研究思路能为大家打开又一扇“单细胞+表观组学”的大门。
2024年1月19日，南方医科大学南方医院泌尿外科谭万龙教授团队在Drug Resistance Updates发表了题为Single-cell transcriptome analysis reveals the association between histone lactylation and cisplatin resistance in bladder cancer的研究论文[3]，首次通过构建膀胱癌单细胞图谱，识别了独特的顺铂耐药上皮细胞群。在顺铂耐药细胞群中发现乳酸化水平升高，并在具有顺铂耐药性的膀胱癌细胞系中得到验证。借助组蛋白乳酸化修饰检测技术——ChIP-seq，作者发现H3K18la在顺铂耐药的膀胱癌细胞系中上调，并提高转录因子YY1和YBX1的表达，最终促进膀胱癌的顺铂耐药性。该研究提供了关于膀胱癌顺铂耐药性机制的新见解。
在这项研究中，作者首先利用单细胞RNA测序技术（scRNA-seq）对膀胱癌（BCa）样本进行了深入分析。通过聚类分析鉴定出了多个不同的细胞亚群，包括上皮细胞、免疫细胞、基质细胞等（图1A, B）。随后，作者特别关注了那些表现出顺铂耐药性的细胞亚群。通过使用Scissor算法（一种结合bulk-sequencing表型数据和单细胞数据的方法），发现在所定义的上皮细胞亚群中特定细胞群epi_clusters 4和5表现出显著的顺铂耐药性（图1C，D）。这些耐药细胞亚群表现出与糖酵解代谢增强相关的特征，即使在氧气充足的情况下也是如此，这与Warburg效应正好相符。此外，作者通过量化每个肿瘤上皮细胞簇的DNA损伤修复能力（DDRs），发现这些细胞亚群还表现出了较高的DDRs，这可能是它们对顺铂耐药性的一个关键因素（图1E）。
图1 生成BCa单细胞图谱并鉴定顺铂耐药簇
作者进一步探讨了顺铂耐药细胞与肿瘤微环境中其他细胞类型之间的通讯关系。结果发现顺铂耐药细胞与血管内皮细胞、癌相关成纤维细胞、巨噬细胞、树突细胞和免疫细胞之间的通讯增强（图2A, B）。受体-配体分析揭示了顺铂耐药细胞中异常激活的分泌蛋白途径，如FN1-CD44、FN1-ITGAV_ITGB1等（图2C）。并使用SCENIC和NetAct算法，发现顺铂耐药上皮细胞中特异性激活的转录因子，可能在顺铂耐药性的形成中发挥关键作用，揭示了上皮细胞群体间的异质性（图3A, B）。随后作者利用逆时序分析，探究了肿瘤上皮细胞从顺铂敏感到顺铂耐药的转变过程，发现顺铂耐药细胞在发育轨迹的末端，表现出高度分化的状态（图4A）。进一步分析表明，肿瘤上皮细胞在分化过程中经历了多次细胞命运选择，最终部分细胞分化为顺铂耐药细胞（图4B）。
研究人员进一步探索了顺铂耐药性与细胞代谢之间的联系。他们发现，顺铂耐药的膀胱癌细胞亚群表现出显著增强的糖酵解活性，而三羧酸（TCA）循环活性则被抑制。这种代谢重编程可能是癌细胞适应并抵抗化疗药物的一种机制（图5A）。
图5 顺铂耐药细胞簇的代谢热图
为了验证这些发现，研究人员建立了顺铂耐药的膀胱癌细胞系（T24R和SW780R）。通过测量细胞的氧气消耗率（OCAR）和细胞外酸化率（ECAR），发现耐药细胞系具有较低的OCAR和较高的ECAR，这与增强的糖酵解活性相一致（图5D, 5E）。此外，顺铂耐药细胞系在培养基中产生了更多的乳酸，这是糖酵解途径的一个关键代谢产物（图5F）。这些发现表明，顺铂耐药细胞可能通过增加糖酵解来满足其能量需求，从而抵抗化疗药物的杀伤作用。在探索顺铂耐药性的分子机制时，作者特别关注了组蛋白乳酸化。他们发现，在顺铂耐药细胞中，组蛋白H3的第18位赖氨酸（H3K18）的乳酸化水平显著升高（图5G, 5H）。
图5 顺铂耐药细胞群中乳酸化上调
紧接上一步发现，作者通过使用糖酵解抑制剂（如2-DG和oxamate）来降低乳酸水平，发现可以减少H3K18la的水平，并恢复细胞对顺铂的敏感性（图6A, 6B）。为了验证这些发现，作者在裸鼠中建立了皮下肿瘤模型，发现顺铂与糖酵解抑制剂联合治疗显著抑制了肿瘤的生长（图6H-J）。
图6 H3K18la促进BCa的顺铂耐药
为了进一步探究H3K18la在顺铂耐药膀胱癌细胞中的基因组分布情况，作者使用了ChIP-seq技术，结果发现H3K18la在顺铂耐药细胞中富集于多个基因的启动子区域，特别是那些与顺铂耐药性相关的转录因子基因，如YY1和YBX1（图7A, 7B）。这表明H3K18la通过调控这些转录因子的表达来影响顺铂耐药性。为了深入了解YY1和YBX1如何调控顺铂耐药性，作者使用RNAi敲低YY1和YBX1的表达后，通过ChIP-qPCR来检测H3K18la在YY1和YBX1基因启动子区域的富集情况。结果显示，H3K18la在这些区域的富集与YY1和YBX1的表达水平密切相关（图7C）。并通过WB实验发现顺铂耐药细胞对顺铂的敏感性增加，这表明这两个转录因子可能通过调控下游基因的表达来促进顺铂耐药性（图 7D）。此外，通过使用乳酸（NaLa）处理细胞，发现可以增加H3K18la的水平，并进一步促进YY1和YBX1的表达，从而增强顺铂耐药性（图7E, 7F）。
图7 H3K18la驱动顺铂耐药性中的关键转录因子
基于上述发现，作者探索了通过靶向YY1和YBX1来克服顺铂耐药性的潜在治疗策略。作者构建了过表达YY1和YBX1的细胞系，发现过表达YY1和YBX1可以显著增加细胞对顺铂的耐药性，这进一步证实了这两个转录因子在顺铂耐药性中的关键作用（图8A，B，C）。此外，作者进行了体内体外实验验证，发现顺铂与靶向YY1和YBX1的小分子抑制剂的联合治疗能够更有效地抑制耐药细胞的生长和存活，并在裸鼠皮下肿瘤模型中，发现敲低YY1和YBX1可以抑制肿瘤生长，并且与顺铂联合使用时效果更佳（图8D，E）。随后通过IHC实验，发现与对照组相比，治疗组的小鼠肿瘤组织中H3K18la、YY1和YBX1的蛋白表达水平降低，这与体外实验结果相一致（图8F）。
图8 靶向YY1/YBX1抑制BCa顺铂耐药
在这项研究中，作者首先通过单细胞RNA测序技术构建了膀胱癌的细胞图谱，识别出对顺铂耐药的细胞亚群，并发现这些细胞表现出增强的糖酵解代谢特征。利用ChIP-seq技术，研究人员进一步揭示了H3K18la在顺铂耐药细胞中的富集情况，特别是在YY1和YBX1等关键转录因子的启动子区域。这些转录因子的激活与顺铂耐药性密切相关。此外，通过抑制H3K18la或YY1/YBX1能够恢复细胞对顺铂的敏感性。这些研究结果表明，通过靶向YY1和YBX1，或者通过调节H3K18la的水平，可能为克服膀胱癌的顺铂耐药性提供了新的治疗策略。这些发现不仅增进了对膀胱癌耐药性机制的理解，而且为开发新的治疗策略提供了重要的分子靶点。
1. Tang F, Barbacioru C, Wang Y, et al. mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nat Methods. 2009;6(5):377-382.
2. Zhang D, Tang Z, Huang H, et al. Metabolic regulation of gene expression by histone lactylation. Nature. 2019;574,575–580.
3. Li F, Zhang H, Huang Y, et al. Single-cell transcriptome analysis reveals the association between histone lactylation and cisplatin resistance in bladder cancer. Drug Resist Updat. 2024;73:101059.
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