Life Med | 杨辉团队开发出非脱氨酶依赖的新型单碱基编辑工具

学术   科学   2024-07-16 23:00   北京  

人类已知的致病基因变异有超过一半是单碱基改变引起的。碱基编辑工具(Base editor,BE)可以实现特定碱基的精准编辑,极大推动了基础研究和临床应用等领域的进展。广泛使用的DNA碱基编辑工具主要有两类:腺嘌呤碱基编辑工具(Adenine base editor,ABE)和胞嘧啶碱基编辑工具(Cytosine base editor, CBE),分别可以实现A-to-G和C-to-T的碱基转换。最近,通过将CBE或ABE与DNA糖基化酶变体融合,研究人员开发了可实现C-to-G转变的CGBE以及可实现A-to-C或A-to-T转变的AYBE。以上提到的碱基编辑工具都是以C或A的脱氨基反应作为关键起始步骤,分别产生尿嘧啶(U)和次黄嘌呤(I)中间体,再通过细胞内源的DNA修复或复制机制转变为其他类型的碱基。目前还没有一种碱基编辑工具可以实现对鸟嘌呤(G)或胸腺嘧啶(T)的直接编辑。由于DNA中的G在现有脱氨酶介导的脱氨基反应后会发生自发的修复,很难引起该碱基的转变;而T缺少氨基,使得开发能够直接编辑G或T的碱基编辑工具存在很大的挑战。
杨辉团队跳出了基于脱氨基反应实现单碱基编辑的思维惯性,创造性地提出了一类不依赖脱氨基化反应的、基于工程化糖基化酶的碱基编辑策略,利用糖基化酶直接切除相应碱基(如G),启动后续的DNA修复机制,最终实现特定的碱基编辑。本研究中,研究人员通过对N-甲基嘌呤DNA糖基化酶(MPG)进行工程化优化,成功开发了不依赖脱氨酶的、可高效实现鸟嘌呤碱基编辑的新型碱基编辑工具gGBE(Glycosylase-based guanine base editor)。该研究对进一步丰富碱基编辑工具包、建立疾病模型及开发新型基因疗法等领域都有着非常重要的意义。
脱氨酶依赖(dBE)与非脱氨酶依赖(gBE)的碱基编辑工具及相关机制示意图
本研究首先获得了高效切除碱基G的糖基化酶。研究团队前期的研究获得了高效切除次黄嘌呤碱基(Hx)的MPG变体,由于Hx与G或A在结构上具有相似性,研究人员检测了多种MPG变体切除G或A的能力。为了评估G或A切除事件的发生以及相应的碱基编辑效率,研究人员设计了基于内含子剪接的可激活荧光报告系统。在该荧光报告系统中,只有发生了A-to-T或G-to-T碱基的转变,才能纠正内含子剪接信号,使剪接过程正常发生,进而激活绿色荧光蛋白(EGFP)的表达。研究发现,将MPGv3变体融合在nCas9的C末端而构建的碱基编辑工具gGBEv3能检测到最高的G-to-T编辑效率,同时无A-to-T的编辑。为了进一步提高gGBE的编辑效率,研究人员基于MPG蛋白结构分析和理性设计,制定了多种蛋白工程优化策略,构建了一系列突变体库,通过多轮筛选,最终获得了对G编辑效率最高的gGBEv6.3,其比带有野生型MPG的gGBEv0.1(0.03%)编辑效率提高了约1693倍。
接下来,研究人员在人类基因组24个靶点上对gGBEv6.3进行了综合评估,发现其可实现高达81.2%的鸟嘌呤编辑效率,产物主要是G-to-C和G-to-T编辑,且G-to-Y(Y = C or T)编辑占比可高达95%,并且sgRNA依赖及sgRNA不依赖的DNA脱靶情况均较低。此外,gGBEv6.3可以有效编辑人类细胞系DMD基因第45号外显子的剪接受体位点,总体编辑效率达30.3%。其在小鼠细胞系及胚胎中也均表现出高效的编辑效率。在新生小鼠中检测到Tyr基因中提前终止密码子(premature termination codon, PTC)的引入效率平均达59.4%,最高可达94.87%,并且只产生很少的indels,超过57%的F0代小鼠表现出白化或嵌合表型。这些结果表明gGBEv6.3在剪接位点编辑和PTC引入等方面具有很大的应用潜力。
值得一提的是,2024年6月8日,杨辉团队在Nature Communications期刊发表了题为:Development of deaminase-free T-to-S base editor and C-to-G base editor by engineered human uracil DNA glycosylase的研究论文,利用非脱氨酶依赖的碱基编辑策略进一步开发出了gTBE和gCBE,实现了碱基T、C的高效直接编辑。
总体而言,本研究首次提出了非脱氨酶依赖的、基于工程化糖基化酶的碱基编辑策略,开发了新型碱基编辑工具gGBE,其具有高效的G-to-Y编辑效率和较低的脱靶水平,极大拓宽了碱基编辑工具的适用范围。本研究提出的碱基编辑策略,可以指导开发更多的基于糖基化酶的碱基编辑工具,为基因编辑研究提供完整的碱基编辑工具组合。
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英文全文链接:
https://doi.org/10.1093/lifemedi/lnae005
引用本文:
Huawei Tong, Tong Li, Hui Yang, Programmable G-to-Y base editing using engineered DNA glycosylase, Life Medicine, Volume 3, Issue 1, February 2024, lnae005, https://doi.org/10.1093/lifemedi/lnae005

作者简介

杨辉

中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心

辉大(上海)生物科技有限公司创始人

&首席科学顾问

高级研究员/博导,国家杰青、国家青年千人、上海市优秀学术带头人、上海市青年拔尖人才、上海市科技系统青年五四奖章个人、中国科学院上海分院杰出青年科技创新人才。长期从事基因编辑研究,在基因编辑工具的开发、优化、递送和疾病治疗转化的研究中,取得了一系列原创性成果,发表通讯作者文章50余篇,研究成果刊登于Science、Nature、Cell、Nat. Methods、Nat. Biotechnol. 和Nat. Cell Biol. 等国际顶级期刊,多项专利获得中、美国家专利授权。“单碱基基因编辑造成大量脱靶效应及其优化解决方法”研究成果入选2019年度“中国生命科学十大进展”。1个基因编辑药物进入临床研究,多个基因编辑疗法获得FDA的等RPDD及ODD认定并进入IND阶段,1个新药已获得临床批件。

制版:太鑫

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