在岁月的长河中，细胞宛如璀璨闪烁的星辰，点缀着我们身体的宇宙。但随着时间的流逝，这些星辰也会逐渐黯淡，走向衰老的宿命。在不同的组织中，细胞衰老的轨迹各异，它们是如何被检测和识别，这是衰老研究领域的关键科学问题。2024年6月3日，美国国立卫生研究院（NIH, National Institutes of Health）细胞衰老网络（SenNet, Cellular Senescence Network）联盟的多个团队在Nature Reviews Molecular Cell Biology发表题为“SenNet recommendations for detecting senescent cells in different tissues”的综述文章。在这篇文章中，研究人员根据对现有文献的全面分析总结，为如何检测不同组织中的衰老细胞提供了建议。文中还讨论了检测和表征细胞衰老的一些最新进展，包括衰老细胞的分子特征和形态学特征，以及循环标志物的使用，为衰老相关研究提供了宝贵的资源。
摘要
细胞衰老曾被认为是体外组织培养过程中细胞的特有现象，但现在已发现它与人类、啮齿动物及其它物种的多种生物学过程相联系，发挥着有益和有害的作用。对衰老细胞生物学的许多理解仍然源自体外组织培养中的细胞研究，在这些研究中，组织培养物中的每个细胞随传代都会进入不可逆的细胞周期停滞状态。与组织培养的细胞相比，在组织中，衰老细胞相对稀少且难以鉴定，不过现在已经确定，有丝分裂后的细胞也可以具备与衰老相似的表型。SenNet 生物标志物工作组的成立旨在为细胞衰老标志物的使用提供建议，以识别组织中的衰老细胞并确定其特征。在这里，研究人员根据对已有文献中报告的14种小鼠和人类组织中的衰老标记物的全面分析，对如何检测不同组织中的衰老细胞提出了建议。本文也讨论了在检测和表征细胞衰老方面的一些最新进展，包括衰老的分子特征和形态学特征以及循环标记物的使用，作者希望这项工作成为对衰老相关研究中经验丰富的研究者和新手都有价值的资源。
引言
细胞衰老传统上被描述为由于应激或损伤而引起的稳定的细胞周期停滞，从而引发多种细胞内表型变化。在人类、小鼠和一些其它物种中，细胞衰老已被证明影响了各种生理和病理过程。
衰老受各种内在和外在因素的影响，并且早在胚胎发育期就可以观察到。尽管衰老是组织修复、伤口愈合和胚胎发育中重要的生理程序化功能，但在其他情况下，它通常是随机性压力的结果，这些压力可能是急性发生的或长期积累的。例如，许多抗癌疗法对健康的非癌细胞具有诱导衰老的副作用，从而导致局部和全身性炎症。
尽管细胞衰老在组织中的驱动机制尚未完全明确，但有证据表明，衰老细胞的积累与慢性炎症相关，并可能对组织功能造成损害。关于随年龄增长衰老细胞积累的原因是衰老细胞生成的更多还是清除的更少，这一点尚不明确。有几条证据表明，免疫系统清除衰老细胞的能力随着年龄的增长而减弱，导致它们在组织中的积累。
近年来，研究人员对揭示细胞衰老的生理功能和病理结果及其潜在分子机制的兴趣日益增加。然而，在体内识别、表征和分离衰老细胞方面仍面临着巨大挑战，部分原因是技术复杂性导致对哺乳动物细胞衰老的理解不够深入。一个关键的挑战是缺乏细胞衰老的特异性标志物，因为几乎所有已提出的标志物在特定情况下（如细胞类型、衰老类型）可能在衰老细胞中缺失，或者它们可能存在于非衰老细胞中。此外，由于缺乏广泛接受的衰老表型定义，进一步阻碍了这一领域的发展。
专家建议的主要目标是：在衰老和疾病背景下，提供关于组织特异性衰老标记物的概述。此外，研究人员旨在提供关于如何利用这些标志物来指导识别和表征健康和疾病组织中多样化的衰老表型。
美国国立卫生研究院（NIH）细胞衰老网络（SenNet）联盟旨在利用先进的单细胞技术，沿着人类和小鼠的整个生命历程映射多种组织中的衰老细胞。SenNet生物标志物工作组在科学文献中注意到一个反复出现的问题，即在衰老及其相关疾病背景下，对于各种组织中的细胞衰老状态的注释过度简化，这一问题因缺乏普遍接受的细胞衰老定义而变得更加严重。重要的是，文献中相当大一部分的研究依赖于均质化组织样本的分析，忽略了不同细胞类型的独特属性。
鉴于这一知识空白，生物标志物工作组致力于精细地审查现有文献，全面整理和总结活体内特定组织和细胞类型中与衰老相关的标志物数据。研究人员重点关注采用单细胞分辨率方法得出的数据，并考虑了细胞类型。此外，选择标准侧重于评估多种衰老相关标志物的出版物。据作者所知，本篇专家建议中呈现的信息汇编，在对现有数据进行全面评估方面，是一项前所未有的努力。这一努力能够帮助制定精确和有针对性的建议，即跨组织检测衰老细胞的SenNet指南（SenGuiDe, SenNet guidelines for detecting senescent cells across tissues），希望能够显著推动该领域的发展。
在本篇专家建议中，研究人员首先介绍了细胞衰老的九大特征，然后探讨了正常衰老和疾病中14种组织中衰老标志物的现有知识，并讨论了在组织中识别衰老细胞面临的挑战。最后，研究人员提供了关于使用衰老标志物、人工智能和循环标记物以及各种技术来识别和表征衰老细胞的建议。
细胞衰老的标志
细胞衰老的特征包括增殖阻滞和抗凋亡通路的上调。衰老的细胞分泌大量的趋化因子、细胞因子、生长因子和蛋白酶，被称为衰老相关分泌表型（SASP, Senescence-associated secretory phenotype）。细胞衰老还表现为染色质结构的改变、代谢适应、损伤大分子的积累和基因组的不稳定性。需要注意的是，单一特征的出现不足以定义细胞衰老状态，因为它们也可能出现在其它细胞状态中。因此，必须同时出现多个特征才能定义为衰老细胞（图1）。
图1：细胞衰老的特征
细胞周期阻滞
许多衰老细胞会积累CDK2抑制因子CDKN1A（也称为p21CIP1）和CDK4/6抑制因子CDKN2A（也称为p16INK4A），导致RB家族蛋白的持续低磷酸化，抑制E2F转录因子，下调增殖标记物MKI67，进而导致细胞周期停滞。这种停滞受多种因素影响，包括E2F靶基因的染色质变化和核糖体生物合成缺陷。然而，目前没有专门指示衰老细胞周期停滞的特异性标记物。RB和p53（由人类的TP53编码，小鼠为Trp53）的活化也出现在其它形式的细胞周期停滞中，而CDKN2A在某些非衰老细胞中也表达，且并不在所有衰老细胞中表达。因此，检测与衰老相关的细胞周期停滞需要量化多个因素和特征。
衰老相关分泌表型
衰老细胞分泌多种促炎细胞因子、趋化因子和白细胞介素，如IL-6、IL-1α和IL-1β，以及细胞生长调节因子、蛋白酶及其抑制因子、血管生成因子和不溶性因子，如纤连蛋白、胶原蛋白和层粘连蛋白，以及其它炎症分子，如GDF15、TGFβ1和IFNγ，统称为SASP。越来越多的证据显示，蛋白质通过外泌体分泌。SASP的成分和强度可以根据衰老持续时间、衰老刺激的来源和特定细胞类型而异。单细胞RNA测序（scRNA-seq, single-cell RNA sequencing）显示在SASP因子的表达中存在显著的细胞间异质性。在衰老后期，干扰素1型反应被触发，部分由长散布元件-1（LINE-1, Long interspersed element-1）逆转录子的去抑制促成。衰老可以传递到邻近细胞，这一现象通常称为继发性衰老。已描述了两种传递机制：通过SASP介导的旁分泌衰老，以及通过NOTCH1–JAG1信号传导介导的近分泌衰老，涉及细胞间直接接触。
细胞核改变
衰老细胞的细胞核经历了巨大变化，具有重要的功能意义。组蛋白的转录后修饰和DNA甲基化改变导致全局异染色质的丢失以及衰老期间局部异染色质的增加，激活LINE-1并出现衰老相关卫星扩张（SADS, Senescence-associated distension of satellites）。Lamin B1（LMNB1）耗竭导致核膜相关结构域的丧失和基因表达的变化。癌基因诱导的衰老特征在于形成衰老相关异染色质灶（SAHF, Senescence-associated heterochromatic foci），这是可见的DAPI密集核心，由组蛋白H3第九位赖氨酸三甲基化（H3K9me3）和H3K27me3修饰的染色质壳组成。这种表型在细胞培养中的其它衰老形式，如复制性衰老中也能观察到，尽管程度较轻。已报道PML核小体通过调控E2F因子介导衰老。HMGB1是属于高迁移率蛋白家族的一种蛋白质，参与调控染色质结构和基因表达，在细胞衰老期间从细胞核释放到细胞外。在细胞外作为免疫细胞的细胞压力或损伤信号。
细胞表面标志物
已有多种蛋白质被鉴定为潜在的衰老细胞标志物，无论是在细胞培养中还是在组织中，均使用可诱导的CDKN2A或CDKN1A表达系统（DEP1、NTAL、EBP50、STX4、VAMP3、ARMCX3、B2MG、LANCL1、PLD3和VPS26A）。此外，DPP4、TNFRSF10D（也称为CD264）、NOTCH1、NOTCH3、CD36、氧化的波形蛋白、ICAM1、uPAR、CD274、PDL2和MHC-I分子也被用作衰老的标志物。
细胞形态的变化
在细胞培养中，衰老细胞经历明显的形态学变化：它们变得扁平、增大并出现空泡化，并可能出现多个或增大的细胞核。衰老细胞建立了细胞质桥，通过直接的细胞间蛋白质转移向邻近细胞传递信号。已观察到培养中的衰老细胞显示出细胞核增大、核起泡和细胞质染色质片段（CCFs, Cytoplasmic chromatin fragments）的形成。CCFs是由于染色质通过核膜起泡而生成，这是由核膜完整性受损介导的，通过cGAS–STING途径触发干扰素反应。
溶酶体含量增加
在衰老细胞中，溶酶体的数量和大小均增加。这种增加主要包括含有不可消化的自发荧光材料的溶酶体，例如脂褐素，它是氧化蛋白质、脂质和金属的聚集物，会积累并可以通过组织化学染色苏丹黑B检测到。增加的溶酶体质量与衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal, Senescence-associated β-galactosidase）活性相关。
代谢适应
衰老细胞的特征是超过增殖细胞的产生能量的氧化代谢，以维持对其生存至关重要的消耗ATP的蛋白应激途径。许多导致线粒体功能障碍的驱动因素也可能导致细胞衰老。这些因素包括线粒体DNA（mtDNA, mitochondrial DNA）耗竭和突变、电子传递链抑制、HSPA9的丧失、SIRT3和SIRT5的丧失，以及呼吸链复合物I组装的紊乱。线粒体功能障碍相关的衰老主要由细胞质NADH积累驱动，导致ATP耗竭、AMPK活化和细胞周期停滞。
衰老细胞的特征还包括活性氧（ROS, Reactive oxygen species）生成增加，主要由功能失调的线粒体产生。细胞内和细胞外的ROS均可促进衰老和稳定细胞周期停滞。衰老细胞中的部分线粒体表现出线粒体外膜通透性，mtDNA由此释放到细胞质中，从而促进SASP。
DNA损伤应答
为应对DNA损伤，细胞会激活DNA损伤应答（DDR, DNA damage response）。DDR通过ATM和ATR介导的p53稳定化触发细胞衰老，从而激活CDKN1A以停止细胞周期进程。持续的DDR还会触发SASP。DNA损伤位点的Ser139磷酸化的组蛋白H2AX（称为γH2AX）促进了检查点因子和DNA修复因子的病灶聚集，包括TP53BP1、MDC1、NBS1和磷酸化的SMC1；在衰老的成纤维细胞中也可以观察到RAD17的磷酸化。在衰老过程中，端粒DNA损伤和磨损已被证明会导致与端粒共定位的DDR灶（例如γH2AX和TP53BP1）的形成，称为端粒相关灶点（TAF, Telomere-associated foci）。
抗凋亡途径的上调
衰老细胞通常表现出参与抗凋亡途径的蛋白质上调。研究表明，通过RNAi靶向生存途径因子（ABL1、EFNB1、BCL2L1、EFNB3、SERPINB2和PI3K），能够显著降低衰老细胞的存活能力，而对非衰老的人类细胞则影响较小。
组织中的衰老标志物
在本节中，研究人员讨论了在正常衰老和衰老相关疾病背景下，目前在小鼠和人类组织中对衰老标志物的理解。研究人员重点关注那些利用多个衰老特征支持细胞衰老存在的研究。在补充表1中可以看到一个按组织分类的标志物数据库。该数据库收录了来自224篇同行评审的论文和328个标志物的信息，涵盖了14种小鼠和人类组织以及循环标志物。一个反复出现的问题是在衰老研究中如何考虑标志物的优先级，研究人员试图根据数据库中的所有工作提供建议。
表1展示了数据库中在三种或更多组织中记录的衰老标志物。总体而言，这些标志物代表了九大衰老特征中的六个，其中SASP最具代表性。在SASP中，IL-6、TNF、IL-1α、IL-1β、SERPINE1（也称为PAI-1）和TGFβ1在超过十种组织中已有报道。值得注意的是，CDKN2A和CDKN1A是细胞周期停滞方面主要报道的标志物。H2AX是跨越多种组织评估DDR最常用的标志物，其次是端粒长度和TAF。SA-β-gal染色显示，11种组织中溶酶体含量增加，而细胞核改变的标志如LMNB1和核HMGB1的丧失分别在5种和7种组织中有记录。抗凋亡因子BCL2的上调在4种组织中被报道。
表1 | 在三个或更多组织中描述的细胞衰老标志物
除了标志物优先级外，研究人员不建议使用单个标志物来确定细胞的衰老状态，因为有足够的证据表明存在大量所谓的假阳性衰老现象（方框1）。如方框2所述，研究人员建议在同一细胞中要存在多个衰老特征。随后，进一步讨论了每种组织中主要发现的的衰老标志物，以及在衰老和疾病中的影响。
方框1：鉴定和表征体内组织中衰老细胞的关键挑战
在这里，研究人员讨论了识别组织中衰老细胞、表征其表型以及区分细胞衰老与细胞其它状态的主要挑战。
• 衰老检测的假阳性。使用标志物区分衰老和非衰老细胞的一个挑战是有充分的证据表明在非衰老细胞中存在衰老标志物。例如，巨噬细胞向M2型的极化导致两种最常用的衰老标志物CDKN2A（也称为p16INK4A）和衰老相关的β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）的表达。为了避免这个陷阱，使用多管齐下的检测方法至关重要（方框2）。
• 免疫细胞衰老。现在几乎所有的组织中都存在细胞衰老的描述，包括免疫系统。但是长期以来使用“免疫衰老”一词来描述衰老时观察到的细胞衰竭和免疫失调状态，而不是涉及细胞周期停滞的细胞衰老，造成了一些混乱。尽管这两个过程在某些层面上是相关的，且都与衰老有关，但在其它层面上它们是不同的。区分免疫细胞标志物和衰老标志物具有挑战性，需要进一步研究以确定它们不同的特征。这类研究对于免疫细胞衰老负担的验证和量化至关重要。
• 有丝分裂后细胞衰老。已经在有丝分裂后细胞如神经细胞、心肌细胞、骨细胞、脂肪细胞和其它细胞中鉴定出许多衰老标志物，并且观察到它们在这些细胞中的水平随着年龄的增长而增加。该领域的一个长期争论围绕着这些细胞是否真的可以被认为是衰老。有证据表明，在体内诱导衰老可以导致类似于在具有增殖能力的细胞中诱导衰老的表型。此外，去除带有衰老标志物的有丝分裂后细胞与小鼠健康结果的改善有关。
研究人员认为，鉴于有一致的证据表明在有丝分裂后细胞中细胞周期抑制因子（如CDKN1A和CDKN2A）、DNA损伤灶、衰老相关分泌表型（SASP）因子以及其他衰老标志物随年龄增长而增加，有丝分裂后细胞应被视作衰老细胞。
方框2：衰老标志物的使用建议
在细胞培养研究中，许多细胞衰老相关的标志物已经有了描述，但单独使用它们缺乏识别组织中衰老细胞的特异性和敏感性。特定的衰老标志物（图1）可以在不同类型的细胞或衰老形式中转化为不同组合的标记物的出现。许多衰老相关标志物也存在于非衰老细胞中（方框1）。研究人员提出了一种多管齐下的方法来识别组织中的衰老细胞，这需要在同一细胞中有多种衰老特征的证据。研究人员建议在组织中至少检测三个标志物来识别衰老细胞。根据参考的文献，研究人员提出了以下特征，并提供了一份可以优先考虑的常见标志物列表（根据文献综述，有星号标记的是最多报道的标志物）。研究人员预计，当使用有限制的低复杂度技术测定单个细胞中的标志物的数量时，这种方法将特别有益。然而，为了全面捕捉衰老细胞的异质性，特别是衰老相关分泌表型（SASP）的异质性，应使用具有数百至数千个基因的高复杂度方法（方框4）。
• 细胞周期阻滞
- CDKN2A上调*
- CDKN1A上调*
- MKI67下调
• DNA损伤应答（DDR）
- γH2AX核灶点的形成*
- TP53BP1核灶点的形成
-端粒相关灶点的形成（TAF）
•SASP
- IL-6*
- IL-1α
- IL-1β
- SERPINE1
注：SASP的组成取决于组织和细胞类型。最常见的SASP基因在一种细胞中不表达并不排除另一种细胞类型特异性SASP可以表达。因此，这些因素的缺乏不应被用作反对细胞衰老的证据。为了真正全面地捕捉SASP，应该利用高通量全转录组方法（如单细胞转录组学）和蛋白质组学。
• 溶酶体含量增加
- 衰老相关的β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）活性*
• 细胞核重塑
- HMGB1的核排除和后续的释放*
- Lamin B1（LMNB1）丢失
- 衰老相关卫星扩张（SADS）
• 抗凋亡通路的上调
- BCL2上调*
- 其它BCL2家族蛋白的上调
心血管系统
多项研究显示，各种心血管细胞谱系，如心肌细胞、心脏间充质基质细胞、心脏成纤维细胞和心脏祖细胞，在衰老和心血管疾病背景下都积累了衰老相关标志物。
在正常衰老过程中，老年小鼠心肌细胞积累以下衰老相关标志物：TAF、周期蛋白依赖性激酶抑制剂（CDKN1a、CDKN2B（也称为p15INK4b）和CDKN2a）、SA-β-gal活性、SADS和促纤维化的SASP。在小鼠体内，老化的心脏间充质基质细胞被鉴定为PTPRC−PECAM1−ATXN1+PDGFRA+（也称为CD45−CD31−SCA1+PDGFRα+）细胞，其克隆和增殖能力下降，与Cdkn1a、Cdkn2b和Cdkn2a以及SASP因子mRNA表达增加相关。在人中，被定义为KIT+PECAM1−PTPRC−（也称为c-kit+CD31−CD45−）的心脏祖细胞在衰老过程中显示出CDKN2A、SA-β-gal活性和γH2AX灶点增加、DNA中掺入的BrdU减少（S期标记物；掺入的减少表示细胞周期停滞）以及SASP的诱导。血管衰老特征为动脉增厚和硬化以及内皮功能障碍。老年小鼠主动脉中有多个衰老相关标志物上调，包括细胞周期抑制剂（Cdkn2a、Cdkn1a和Trp53）、DNA损伤灶和SASP因子。在老年小鼠的动脉中，内皮细胞和血管平滑肌细胞，即主动脉的主要细胞类型，在衰老过程中会出现衰老相关标志物。
小鼠心肌梗死伴随着衰老相关标志物的表达增加，如CDKN2A和CDKN1A、SA-β-gal活性、TAF以及在小鼠心肌细胞和心脏成纤维细胞中SASP组分的增加。在心血管疾病的背景下，如动脉粥样硬化和腹主动脉瘤及胸主动脉瘤中，也已经发现了衰老相关标志物。在小鼠动脉粥样硬化模型（Ldlr–/–）中，晚期动脉粥样硬化病变表现出SA-β-gal表达和Cdkn2a以及典型SASP组分的上调。此外，在人中，从动脉粥样硬化斑块中分离出的血管平滑肌细胞也表达衰老相关标志物，包括CDKN1A、CDKN2A和SA-β-gal活性。在胸主动脉瘤和腹主动脉瘤的人和小鼠模型中，也观察到衰老相关标志物，包括CDKN1A、p53、总γH2AX和与端粒相关的γH2AX（TAF），以及SASP因子。
免疫系统
老年的免疫衰老导致了感染易感性的增加和对疫苗反应性的降低。这种表型可能涉及细胞衰老的元素，特别是在T细胞中，尽管在特化的有丝分裂期后的免疫细胞中可能存在不同的机制。研究表明，包括单核细胞和组织驻留巨噬细胞在内的免疫细胞是SASP因子的主要产生者，如IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF和HMGB1。由于SASP的特征与免疫细胞的特征重叠，因此必须确定能区分激活的组织驻留免疫细胞和真正衰老细胞的标志物。这一未解决的需求在该领域仍然是一个重要的空白，对免疫系统中衰老的研究构成了挑战。
组织驻留免疫细胞，如巨噬细胞、2型先天淋巴样细胞、自然杀伤细胞、B细胞和效应记忆T细胞，依赖于增殖来维持自身。这些细胞亚群都显示出与年龄相关的功能障碍，并产生与SASP因子重叠的促炎细胞因子，从而提供了关于年龄和衰老对免疫细胞影响的证据。近年来在老年人血小板中发现了SELP（CD62P）、CD40LG和CD63水平增加，提示存在与衰老相关的血小板活化增加。具有高SA-β-gal活性的CD8A+的T细胞亚群，也表现出端粒功能障碍和CDKN2A介导的衰老特征，而CD8A+效应记忆T细胞则显示由p38 MAPK调节的SASP。
使用外周单核血细胞的转录和翻译检测已确定了各种细胞周期调节因子，包括CDKN2A、p53、CDKN1A、CDKN1B和p38 MAPK，并且这些标志物的变化与衰老和/或各种慢性疾病相关联。SenMayo基因集（方框3）的分析显示，老年受试者骨髓中大约50%的单核细胞可能是衰老的。从老年小鼠和缺乏ERCC1的小鼠（这是一种关键的DNA修复蛋白质）血液中分离出的CD3+ T细胞显示多种衰老标志物水平增加，包括Ccl2、Tnf、Il1b、Inhba、Spp1、Cdkn2a和Cdkn1a。相反，疫苗激活的小鼠CD8A+ T 细胞转移到新的小鼠体内后，其功能和增殖能力可保持到原小鼠寿命结束之后，这表明衰老决定因子没有随T细胞转移，并可能源于新宿主。此外，需要注意的是，由于表达CDKN2A的外周单血核细胞在冷冻保存过程中似乎无法存活，因此主要使用从新鲜血液中分离的CD3+细胞的定量PCR（qPCR）分析CDKN2A mRNA水平，以确保能够反映出衰老细胞亚群的特征。最近的研究报告称，循环衰老髓样细胞驱动神经退行性病变和脑炎。
方框3：使用细胞衰老特征和人工智能鉴定衰老细胞的建议
新的计算工具利用了目前可用的单细胞转录组学数据的高通量特性，超越了使用一小部分单独的标记物来识别衰老细胞。通过检查衰老细胞中已知改变的基因的转录谱来评估单个细胞的衰老状态。这些特征是基于现有文献中精心挑选的基因构建的，或者是从参考数据集的分析中实证得出的。美国国立卫生研究院（NIH）细胞衰老网络（SenNet）最广泛使用的两个特征是SenMayo和SenSig。
SenMayo衰老特征是一组在15项研究中精选的在衰老和/或衰老相关分泌表型（SASP）分泌细胞中富集的125个人类基因和119个小鼠基因。值得注意的是，该列表不包括常用的标记物，如CDKN1A（也称为p21CIP1）和CDKN2A（p16INK4A），它们用于验证骨活检中的SenMayo特征。SenMayo中的大多数基因是SASP基因。考虑到SASP在不同细胞类型和衰老形式中的异质性，从多项研究中筛选出的SenMayo基因集可能在不同的环境中捕捉衰老表型。然而，在存在广泛炎症的情况下，其对SASP基因的偏向也可能导致更高的假阳性率；因此，在这种情况下应谨慎使用。
SenSig衰老特征来源于从p16-CreERT2; Ai14报告小鼠中的异物反应驱动的纤维化模型中分离的Cdkn2a+和Cdkn2a-细胞之间的单细胞差异表达分析。这项分析提供了一组基于经验的1,803个基因。迁移学习和衰老评分被用于识别小鼠和人单细胞转录组学数据都存在的衰老细胞。SenSig基因集包含代表多种衰老特征的基因，但也包含大量可能在异物反应驱动的纤维化模型中具有衰老特异性而在其它环境中则不存在的基因。尽管如此，当标记数据可用时（例如CDKN2A+和CDKN2A-细胞的转录谱），SenSig可以通过应用相同的迁移学习模型来适应和扩展到其它环境。然而，需要注意的是，由于大多数单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据集中有许多CDKN2A基因丢失（方框5），研究人员不建议使用CDKN2A计数来标记数据，因为CDKN2A-类别将包含大量CDKN2A+细胞，并对迁移学习产生负面影响。
最近一种替代方法被开发出来鉴定人脑中的衰老细胞，尤其是阿尔茨海默病患者的衰老细胞。产生了三个反映典型衰老途径的基因集，包括细胞周期停滞（22个基因）、早衰上调的基因（48个基因）和SASP（44个基因）。主成分分析用于计算每个基因集中所有基因的加权平均表达，称为基因集的特征基因。然后在单细胞转录组学数据中使用特征基因水平来区分衰老细胞和非衰老细胞。尽管该基因集合在阿尔茨海默病研究中表现良好，但在其它情况下与SenMayo和SenSig相比的表现尚不清楚。
目前还缺乏对这些人工智能方法的性能进行彻底的比较。考虑到它们的互补性，研究人员建议应用和对比不止一种方法：因为被鉴定为衰老的细胞之间的巨大差异表明，一种或多种方法在特定情况下可能不可靠，需要进一步研究。值得注意的是，尽管这些方法仅用于单细胞转录组学数据，但一旦可以，它们也适用于单细胞蛋白质组学数据。
最近的工作表明，机器学习和新兴的人工智能工具通常可以用于根据衰老细胞的不同形态特征来识别衰老细胞。通过分析从用DAPI或CellMask（细胞膜的标志物）染色的细胞中提取的62个形态特征，当比较不同类型诱导的衰老细胞与其增殖对照时，可以确定各种表型特征的显著变化。通常用scRNA-seq数据集分析的无监督学习算法，如t-分布随机邻域嵌入算法和均匀流形近似与投影，能够根据细胞的形态对细胞进行聚类，并区分不同的衰老形式。
人工智能模型已显示出在对衰老细胞进行高精度分类方面的前景。当区分过氧化氢诱导的、喜树碱诱导的或重复传代诱导的衰老及其各自的对照时，在单细胞分辨率的相位对比图像上训练和测试的卷积神经网络实现了0.93的多类分类准确度。DAPI染色的细胞核被用于从增殖对照中识别电离辐射和复制应激诱导的衰老细胞，使用深度神经网络准确率高达0.95。这些基于形态学的深度学习模型有望成为筛选潜在抗衰老药物的先进工具。
使用这些工具的主要障碍是计算性的，因为它们依赖于基本的显微镜来提取细胞形态。由于这些方法需要一个基本事实数据集来进行训练，所以它们大多是使用培养中的细胞开发的。目前尚不清楚这些方法将如何检测不同组织中的衰老细胞，尽管有一些令人鼓舞的结果表明它们适用于组织。因此，研究人员建议将其用于初步筛选，但还需要更多的工作来将其适用性扩展到组织中存在的细胞异质性水平。这些技术非常适合扩展最新一代提供单细胞形态数据（方框5）的空间多组学数据集中的特征空间。
骨髓
骨髓具有依赖于间充质干细胞、造血干细胞及其它细胞增殖和分化的动态组织微环境。骨髓中血管、间充质和网状细胞群之间的生理平衡维持了适当的造血干细胞微环境，这对于不同血细胞的生成是必须的。研究发现，骨髓中存在由致癌基因、辐射和衰老诱导引起的衰老细胞堆积。这些细胞存在于不同的组织分区中，与正常细胞相比，它们的功能受损从而导致免疫系统衰退、骨质疏松症和癌症等疾病。
在急性髓系白血病小鼠模型中，骨髓细胞的qPCR显示衰老标志物Cdkn2a、Cdkn1a和SASP因子的上调，以及Lmnb1的下调。在辐射诱导衰老模型中，SA-β-gal阳性细胞的百分比增加，同时Cdkn2a、Cdkn1a和多种SASP因子的标志物也上调。（骨髓和骨中的间充质细胞衰老将在下文讨论；参见“骨骼”部分。）与小鼠类似，骨髓衰老的标志物已在老年人样本中发现。通过qPCR分析骨和骨髓组织的针刺活检显示CDKN2A和CDKN1A水平增加，并且随着年龄增长，SASP也增加。单细胞转录组学显示CDKN1A、TGFB1和SASP因子的增加。
中枢神经系统
人和小鼠中枢神经系统的有丝分裂后细胞和祖细胞，包括神经元、微胶质细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞系细胞和内皮细胞，在衰老和疾病背景下表现出细胞周期调控因子（CDKN2A、TP53和CDKN1A）和SASP因子（CCL2、IL1A、IL1B、IL6、MMP1、MMP3、SERPINE1、SPP1和TNF）的过表达。在与衰老相关或神经退行性疾病相关的神经元和胶质细胞中，SA-β-gal活性增加以及凋亡（Bcl2）和DNA损伤（γH2AX和磷酸化p38 MAPK）调节因子的表达增加，以及LMNB1的下调作为额外的特征。使用药理遗传学和药理学清除衰老细胞的小鼠模型验证了这些标志物及其相应的衰老或疾病表型的调节。重要的是，在衰老的小鼠和人大脑中，衰老的复杂异质性需要进行特定细胞类型和区域特异性的表征。
脑的衰老特征也存在于受神经退行性病变如阿尔茨海默病和帕金森病影响的组织中。对阿尔茨海默病患者大脑的单细胞核测序揭示了与兴奋性神经元中的Tau病理重叠的衰老标志物，并通过计算识别出CDKN2D作为阿尔茨海默病的顶级衰老标志物。阿尔茨海默病的尸剖组织相对于对照脑组织显示内皮细胞和小胶质细胞中SERPINE1、CDKN2A、CDKN2D、CDKN1A、IL-1β、IL-6和CXCL8的水平升高。阿尔茨海默病和tau蛋白病小鼠模型的神经元和胶质细胞中都显示了重叠的标志物谱，且疾病相关表型表现出对抗衰老药物的反应。
与健康人的大脑相比，帕金森病患者的黑质中SATB1（一种CDKN1A抑制因子）水平降低，CDKN2A、MMP3、IL-6、IL-1α和CXCL8水平升高，表明衰老负担增加。最后，小鼠氧化应激（包括辐射）、代谢和炎症应激（包括肥胖和酒精中毒）模型概括了小鼠大脑中年龄和疾病相关衰老的特征，其特征是CDKN2A、CDKN2D、CDKN1A、p53、IL-1α、IL-1β、IL-6和SA-β-gal活性增加。
脂肪组织
脂肪组织中衰老细胞的积累与衰老和年龄相关疾病的组织功能障碍有关。人和小鼠脂肪组织中的衰老细胞的特征是CDKN2A和CDKN1A表达，SA-β-gal活性更高，DNA损伤（γH2AX）和细胞增殖阻滞（MKI67），以及SASP因子表达，包括IL-6、CXCL8（也被称为IL-8）、IL-1β、TNF、CCL2、SERPINE1、MMP3和MMP12。
来自老年供体（人和小鼠）的脂肪组织来源的间充质干细胞表现出衰老特性和再生潜能受损。一项单细胞转录组学研究发现，老年小鼠脂肪组织来源的间充质干细胞中存在Cdkn1ahigh衰老样细胞群，并伴有Il6、Il15、Vegfa、Cxcl2、Ccl2和Cxcl1上调。值得注意的是，在自然衰老和肥胖中，Cdkn1ahigh细胞的积累比Cdkn2ahigh细胞的积累更多。重要的是，Cdkn1ahigh细胞和Cdkn2ahigh细胞作为两个不同的细胞群存在，表明脂肪组织中衰老细胞群的异质性和复杂性。
成熟的人类脂肪细胞在肥胖和高胰岛素血症的刺激下经历衰老，表现出过早衰老的转录组和分泌谱特征，包括CDKN2A、CDKN1A和CCND1基因表达上调，HMGB1和HMGB2基因表达下调。此外，SASP蛋白CXCL8、SERPINE1、CXCL2和MMP14的分泌增加。随着衰老和肥胖，来自衰老细胞的SASP因子激活了脂肪免疫细胞中的CD38，从而降低了NAD+水平，导致代谢功能障碍增加和整体健康水平下降。肥胖时，TNSF8+PDCD1+CD44hiCD4+（CD153+PDCD+CD44hiCD4+）T细胞在脂肪组织中积累，并呈现衰老特征，包括SPP1、CDKN2A和CDKN1A表达增加，SATB1、DUSP10和EEF1A1表达降低。
此外，在衰老等条件下，脂肪组织中某些标志物的表达与衰老呈正相关，包括IFI27、INHBA、BDNF、NRIP1和CCAR2。相比之下，KL、SIRT1、SREBF1、GDF15、MDM2、RRAD和GBP1等标记物被报道为脂肪组织中细胞衰老的负调控因子。
肾脏
在健康衰老和肾脏疾病中，在许多人和小鼠肾细胞类型中观察到衰老。小鼠肾小球内皮细胞和近端小管上皮细胞（TECs, Tubular epithelial cells）随着年龄增长而衰老，SA-β-gal染色和Cdkn2a表达增加。衰老的肾小球内皮细胞过表达CDKN1A、DNA损伤标志物TP53BP1和γH2AX以及SERPINE1。Serpine1过表达引起足细胞脱落和凋亡，导致肾小球硬化。老年小鼠肾脏衰老足细胞过表达衰老标志物和SASP因子，包括Irf5、Cebpb、Jdp2、Ccl2、Ccl3、Ccl5、Ccl8、Mmp12、Mmp13和Gsk3b。Il1b、Il6和Mmp13在老年小鼠肾脏中也上调。在急性肾损伤、糖尿病肾病、肾小球肾病、慢性肾病和慢性缺血性肾损伤模型小鼠的肾脏中也观察到衰老细胞。不同肾脏疾病的动物模型均表现出SA-β-gal活性升高和Cdkn2a、Cdkn1a、Trp53和SASP组分（包括SERPINE1、IL-1β、IL-6、TNF和MMP13）过表达。SERPINE1在糖尿病早期肾损伤中驱动肾小球硬化。
对人衰老肾脏中衰老细胞的研究大多使用的是来自病变肾脏的组织学上正常的组织（肾脏的无病区域）。CDKN2A、CDKN1B、CDK4、MMP1和HSPA5 mRNA水平在皮质中升高，CDKN2A的细胞核染色主要在远端小管和集合管中观察到，但也在肾小球壁上皮和足细胞中观察到。CDKN2A蛋白的表达在皮层间质细胞和TECs中与年龄相关；相比之下，CDKN1B蛋白的表达仅在皮质小管细胞中与年龄相关。CDKN2A在肾动脉血管平滑肌细胞中的表达增加。PTGS1和PTGS2在衰老肾脏中的表达增加。脂褐素存在于成人和老年的髓质小管细胞以及老年肾脏的一些皮质小管中。端粒在皮质中较短，但在髓质中则不是这样。衰老肾小球内皮细胞产生的SERPINE1和CDKN2A在健康肾脏供者肾脏中随着年龄的增长而增加。大多数人类肾脏疾病与细胞加速衰老有关，CDKN2A在TECs中过度表达最多。在慢性肾脏疾病中表达CDKN2A的TECs诱导的WNT9A与MKI67阴性的细胞核（指示非增殖细胞）共定位。此外，核CDKN2A水平在肾小球疾病患者的肾小球和间质细胞中升高，在糖尿病肾病患者的小管和足细胞中也升高。值得注意的是，最近的一项研究表明，由于血管和溶血损伤或其它原因，铁的积累会促进肾脏和其它器官的纤维化和衰老。衰老细胞也持续积累铁，即使细胞外铁水平在损伤后恢复正常。
肝脏
细胞衰老与年龄依赖性肝功能障碍和各种慢性肝病（如纤维化、肝硬化、非酒精性脂肪肝病、酒精性肝病和慢性肝炎）的发展有广泛的关系。多种肝细胞类型，包括肝细胞、肝星状细胞、内皮细胞、库普弗细胞和胆管细胞，在衰老和与年龄相关的疾病中表现出衰老相关标志物。
对衰老小鼠肝细胞的研究表明存在衰老相关标志物，如SA-β-gal活性、TAF、核增大、SADS、LINE-1表达和SASP因子表达。尽管对人肝细胞衰老的了解比小鼠少，但在人肝硬化组织中已经发现了衰老相关标记物，如SA-β-gal染色。此外，CDKN1A、CDKN2A表达和TAF的存在已在非酒精性脂肪肝病中被发现，TAF也已在酒精性肝病患者的肝脏中被报道。
小鼠肝星状细胞在肝损伤模型中也显示出衰老相关的标志物，如SA-β-gal活性和Cdkn1a、Cdkn2a及SASP成分的表达。原发性胆汁性肝硬化是一种以慢性进行性胆汁淤积和肝功能衰竭为特征的自身免疫性疾病，在胆管细胞中发现了衰老相关的标志物。
肺
CDKN2A是与肺衰老相关的主要标志物。已经开发了各种小鼠模型来研究CDKN2A驱动的肺细胞衰老对外部应激源的反应。CDKN1A、p53和γH2AX在小鼠和人的肺中也随衰老而上调。此外，SERPINE1在纤维化肺病中通过激活p53-CDKN1A-RB1通路诱导小鼠肺泡2型（ATII, Alveolar type 2）细胞衰老。TGFβ1参与介导肺细胞衰老，TGFβ1–IL-11–MEK–ERK信号传导介导小鼠衰老相关的肺纤维化。细胞外HSP90AA1激活TGFβ1信号，促进Trp53和Cdkn1a表达来诱导小鼠和人肺成纤维细胞衰老。在损伤性衰老小鼠模型中，SASP因子包括细胞因子（如IL-1α、IL-1β、IL-10、TNF、TNFRSF1B和TNFSF12）、趋化因子（如CXCL2和CXCL12）和蛋白酶（如MMP8和MMP12）均显著上调。
衰老细胞的积累也与肺的结构变化有关，通常被称为“老年性肺气肿”。最近的研究表明，老年哮喘患者气道平滑肌细胞中Trp53和Cdkn1a的表达增加，且存在TAF。
越来越多的证据表明，肺气肿疾病中肺II型上皮细胞、内皮细胞和成纤维细胞的细胞衰老增加。研究表明，细胞周期阻滞标志物（如CDKN1A和p53）、SASP因子（如CXCL5、CXCL8和VEGFA）、SA-β-gal活性和γH2AX的增加与慢性阻塞性肺病的细胞衰老增加有关。在慢性阻塞性肺病小鼠模型中，由CDKN2A介导的衰老现象被发现能够影响因吸入香烟烟雾而诱发的衰老反应。同样，衰老肺成纤维细胞在纤维化肺病的发病机制中起关键作用。血浆中GDF15、IL-6、CRP和TNFRSF1B的上调与肺间质性异常发生的易感性有关。在特发性肺纤维化中，衰老成纤维细胞的另一个标志是抗凋亡BCL2家族蛋白（如BCL2L2、BCL2和BCL2L1）的表达增强，以及促凋亡蛋白BAK1和BAX的水平降低。相比之下，最近的研究提供了铁在小鼠和人衰老纤维化组织中积累的证据，从而强调了细胞代谢在衰老中的作用。铁螯合疗法是否能逆转衰老、纤维化或阻塞性肺病还有待观察。
胰腺
据报道，人遗体胰岛中SA-β-gal+细胞比例是年龄依赖性增加的。2型糖尿病在所有年龄段中显著增加了这一比例，并伴有更高强度的DNA损伤标记TP53BP1。高脂饮食和胰岛素受体拮抗剂S961诱导的胰岛素抵抗小鼠模型显示SA-β-gal活性升高，Cdkn1a、Cdkn2a和SASP因子Il1a、Il6、Tnf、Ccl3、Ccl4、Ccl5、Cxcl1和Cxcl10的表达升高。通过对衰老（SA-β-gal+）和非衰老（SA-β-gal-）小鼠和人胰岛细胞的蛋白质组学分析，证实了SASP蛋白因子的分泌，并在β细胞中描述了一种独特的SASP。在1型糖尿病（NOD）小鼠模型中，观察到许多衰老标志物如Cdkn1a、Cdkn2a、H2ax、Il6、Mmp2、Serpine1、Il6和Igfbp3的表达。其中一些因子也在1型糖尿病供体的胰岛中被发现。此外，性别偏倚的胰岛β细胞功能障碍能由一种由于MAFA S64F变异引起的青年成熟型糖尿病导致，其中转录因子MAFA中的单个氨基酸替换导致男性糖尿病和衰老细胞的积累。这些细胞的特征是表达Cdkn1a、Ankrd1、Bcl2a1d、Ccl11、Cd68、Cxcl12和Icam1，SA-β-gal活性和Lmnb1表达降低以及γH2AX表达增加。
在NOD小鼠的α细胞中也发现了衰老标志物，如Cdkn1a、Cdkn2a和核Hmgb1丢失，尽管其速率低于相同小鼠的β细胞。然而，另一项研究没有在NOD小鼠的α细胞或1型糖尿病供体的胰腺中发现任何衰老标志物。在胰腺的成年细胞系中，腺泡细胞表现出最高的可塑性，允许它们在被称为腺泡向导管化生的过程中经历去分化或转分化到表达导管标记的胚胎前体表型。在腺泡向导管化生过程中，去分化的腺泡细胞进入衰老状态，其特征是细胞周期停滞，p53、CDKN1A、CDKN2A和SA-β-gal活性被诱导。在慢性胰腺炎患者中也发现了同样的情况。
在一项对140名无胰腺疾病个体死后的胰腺的研究中，114人（81%）表现出导管病变，如粘膜细胞增生，通常与KRAS激活突变相关；在40岁以后导管病变呈增加趋势。这些KRAS突变也在胰腺导管腺癌的早期阶段被发现，在衰老标志物如p53、CDKN2A和SMAD4出现之前。然而，由于这是一项横向研究，这种关系只是暗示性的，还需要进行纵向研究来证实这些事件的时间顺序。
在一项涉及158例导管内乳头状粘液瘤和10例正常对照的研究中，在正常对照中既没有观察到SA-β-gal活性，也没有观察到SAHF形成。然而，在肿瘤组织中，特别是在低级别发育不良的情况下，检测到四种衰老标志物（CDKN2A、CDKN2B、SA-β-gal活性和CBX5-γ）。有趣的是，这些标志物在向导管内乳头状黏液瘤的转变过程中大量减少。这些发现表明衰老是在早期肿瘤阶段诱导的，可能在防止恶性肿瘤的进展中起作用。
骨骼
在老年小鼠中，利用磁性激活细胞分选和qPCR技术在成骨细胞祖细胞、成骨细胞和骨细胞中发现了衰老标志物。成骨细胞祖细胞和成骨细胞中除少量SASP因子增加外，Cdkn2a显著增加。骨细胞的SADS随着年龄的增长而增加，Cdkn2a、Cdkn1a和Trp53以及大量SASP转录本也增加。
最近的一项研究使用质谱流式技术（CyTOF, Cytometry by time of flight）分析了年轻和老年小鼠骨骼中的蛋白质水平。骨微环境中的衰老细胞主要由CD24+骨系细胞和晚期成骨细胞/骨细胞组成，定义为CDKN2A+Ki67-BCL2+和CDKN1A+Ki67-BCL2+，其它衰老标志物、SASP因子和DNA损伤标志物显著增加。尽管在小鼠中清除表达CDKN2A的破骨细胞祖细胞并不能减轻与年龄相关的骨质流失，但破骨细胞是否也会发生衰老尚不清楚。
在人体骨骼活检中，与年轻女性相比，老年女性（平均年龄78岁）CDKN2A、CDKN1A和衰老相关趋化因子（如CCL2、CCL3、CCL8和CSF1）的mRNA表达上调。SenMayo基因集（方框3）在两组老年人群的骨活检中生成并得到验证。在青春期后期，间充质干细胞/祖细胞经历正常的程序性衰老，这表明巢蛋白表达的缺失。
小鼠骨折后，来自骨折愈伤组织的细胞初始表现出Cdkn1a mRNA表达的增加，随后Cdkn2a表达增加，并伴随着由大量白细胞介素、NF-κB下游因子和TGFβ1表达组成的SASP。局部放射治疗引起的疾病状态也会诱导骨骼衰老，其特征与骨折相似，包括Cdkn1a的早期表达和Cdkn2a的晚期表达。靶向表达Cdkn1a而非Cdkn2a的衰老细胞可以减轻局部放疗诱导的骨质丢失，这表明衰老细胞亚型之间存在功能异质性。
2型糖尿病也与骨骼细胞衰老有关。在2型糖尿病小鼠模型（高脂肪饮食加链脲佐菌素）中，骨细胞富集的样本显示Cdkn2a和Cdkn1a，以及主要与NF-κB信号传导和基质金属蛋白相关的SASP标志物的表达增加。在衰老和上述疾病状态下，骨骼细胞衰老也可以通过SA-β-gal活性、SADS和TAF的组织学染色观察到，通常在骨包埋的骨细胞中。
皮肤
皮肤衰老受到环境因素（如紫外线辐射）的影响，这使得发现可靠的衰老标志物具有挑战性。通过表皮和真皮层中SA-β-gal、α-岩藻糖苷酶、CDKN2A、CDKN1A和脂褐素的表达，以及人表皮（尤其是棘层）中组蛋白变体H2AJ和γH2AX的表达来鉴定皮肤的衰老。这种表达模式与较低的MKI67表达相关，仅与端粒长度减少轻微相关。染色质异常增强衰老是皮肤衰老的共同特征，其特征是TP53BP1和PML核灶阳性。在晒过的皮肤中，黑色素细胞的衰老率最高，这可以通过CDKN2A的表达和TAF数量的增加以及核HMGB1的丢失来确定。
尽管具有很高的可变性（例如，体内固有衰老的人成纤维细胞的SASP包括27种不同的蛋白质)，但GDF15、TNF、SPP1、TNFRSF1A、FAS、CCL3、IL-15和激活素A表达与年龄相关的疾病结果之间存在关联。在体外培养的成纤维细胞、角化细胞和黑色素细胞中，经典的SASP通常包括IL-6、IL-1α、IL-1β、MMP1、MMP3、MMP9和TNF，而在衰老皮肤的真皮成纤维细胞的SASP中发现了高水平的趋化素。
光损伤标志物包括53BP1、H2AJ和mtDNA4977（一种常见的mtDNA缺失）的积累。UVB重复暴露导致人角质形成细胞和小鼠表皮中LMNB1的丢失。紫外线辐射引起的日晒斑（肝斑）的早期发展特征是表达CDKN2A、CDKN1A和p53以及TNF升高的黑色素细胞的积累。在UVB的作用下，原代人黑色素细胞的SASP分泌的IL-6、CXCL8、CCL1、CCL2和HMGB1水平升高。紫外线照射小鼠模型显示Mmp1、Mmp2、Mmp3以及其它SASP因子如TNF、IL-1β、IL-6的表达增加。
在小鼠皮肤化学致癌模型中，佛波酯TPA对肿瘤的促进作用表现为高CDKN2A水平的SA-β-gal+角质形成细胞的增加，伴随着Mmp3、Mmp9和Cxcl10水平的增加和Lmnb1水平的下调。黑色素瘤和人类痣的小鼠模型（都是癌基因驱动的）显示SA-β-gal+-CDKN2A+灶累积。此外，在一半以上的恶性皮肤黑色素瘤中发现的BRAF致癌突变也常见于非恶性痣，在非恶性痣中，BRAF致癌突变引起癌基因诱导的衰老，表现为CDKN2A和SA-β-gal的高水平表达。
乳腺
在衰老过程中，TNFRSF11A的表达增加，其通过Cdkn2a导致DNA损伤和衰老。衰老标志物在老年小鼠乳腺和培养的原代人乳腺上皮细胞中均有发现。Cdkn2a在老龄（25-32月龄）小鼠乳腺基质细胞中的表达上调约20倍。免疫染色显示，随着年龄的增长，表达SASP因子COX2的导管频率增加。其它炎症特征，如巨噬细胞冠状结构和Cxcl1、Cxcl2、Cxcl16、Csf1、Csf3、Ccl5和Il6，在老年小鼠乳腺中也升高。
卵巢
大多数关于卵巢衰老的研究都是在动物模型上进行的。卵巢比人体其它器官衰老得更早，因为女性的生殖功能在35岁左右开始下降，并在绝经时完全停止。这一衰老过程的特点是配子数量减少和质量降低，导致生殖衰老。此外，卵巢表现出年龄依赖性炎症和纤维化。然而，这些是否与衰老有关还没有最终确定。
在高龄生殖小鼠的卵巢中，被归类为衰老的细胞以Cdkn2a、Cdkn1a、Serpine1和Hmgb1的表达增加为特征。此外，这些细胞表现出溶酶体含量增加，这可以通过脂褐素聚集体（称为“聚集体”）的积累和基质室中SA-β-gal染色来证明。SASP因子如Ccl8、CCL5和促炎相关基因Crlf1的分泌也随着年龄的增长而增加。
除了生理衰老外，遗传毒性药物（如化疗药物顺铂和阿霉素）治疗会加速生殖衰老，导致SA-β-gal、CDKN2A和CDKN1A表达增加。此外，它们引起了SASP的成分，如IL-6、Ccl2和Tgfb1表达增加。在卵巢加速衰老的遗传小鼠模型中，Cdkn2a、Cdkn1a、Il1a和Il1b水平升高。此外，在卵巢功能不全的小鼠模型中，观察到卵巢中SAHF的形成，表现为H3K9me3和CBX5染色增加以及HMGA1和HMGA2蛋白表达增加。
人绝经后卵巢单细胞表达和染色质可及性分析显示，SASP相关基因在基质细胞（如SERPINE1、TIMP1、TIMP2、IGFBP2、IGFBP3和IGFBP4）、内皮细胞（如IGFBP7）和血管周围内皮细胞（如CDKN1A）中表达。此外，一些CCL和CXCL基因在人绝经后卵巢的免疫细胞中表达，可能逆转衰老的一些有害影响。
胎盘
发育性衰老是一种程序性的短暂细胞衰老，在哺乳动物胚胎发育中起着至关重要的作用，不仅发生在胚胎中，也发生在胎盘中。滋养层细胞分化为大型间充质外滋养细胞和多核连续合胞滋养细胞，表现出衰老的几个特征，包括复制潜能丧失，细胞周期抑制剂（特别是CDKN1A、CDKN1C、p53和MAPK14）表达增加，SA-β-gal活性和脂褐质沉积增加，SAHF形成，TAF和SASP因子如IL-6、IL-1β、MMP9、HMGB1、GDF15和TNF介导免疫监视和组织重塑。此外，胞外滋养层细胞表现出核增大，合胞滋养层细胞表现出衰老和老化的特征，如合胞体结增加、纤维蛋白沉积和细胞骨架重组。此外，合胞滋养层细胞的线粒体发生形态和功能变化，其特征是体积减小和ATP产生减少，从而导致ROS产生增加，以适应胎盘中氧张力的变化。
除了滋养层细胞衰老（一种生理现象，随着妊娠的进展，并在足月达到顶峰），衰老在母体蜕膜细胞和胎儿胎盘膜（在足月时，它在促进分娩和胎盘从子宫脱离中起着关键作用）中也有广泛的描述。最近，高度特异性的合体滋养层基因被发现在生理性衰老的成纤维细胞中，以及在非滋养细胞系的复制性衰老或应激诱导的细胞衰老过程中被诱导。这一遗传程序表明，胎盘发育性衰老的组成部分在其它细胞衰老的背景下重现。
胎盘也可能在不良妊娠结局中加速或过早衰老，如先兆子痫和胎儿生长受限。与正常生长胎儿胎盘相比，胎儿生长受限的胎盘的端粒更短，CDKN2A、CDKN1A蛋白和EEF1A1 RNA表达水平更高。
结肠
关于结肠衰老的信息有限，研究团队没有将该组织纳入数据库。据报道，匀浆组织中衰老小鼠结肠中几种衰老标志物增加。衰老相关的组织微环境促进了人结肠上皮细胞和人来源的结肠类器官中结肠癌的形成。
术语表
假阳性衰老：一种细胞表型，其特征是在非衰老细胞中存在衰老标志物。
基因丢失：指在单细胞转录组学中，无法检测或量化某些基因，通常是由于mRNA丰度低。
免疫衰老：免疫细胞的年龄依赖性功能下降，包括naïve细胞出现次数降低，衰竭增加，先天免疫和信号通路失调。
核增大：指肝细胞核增大，与肝重量增加或细胞衰老有关。
长散布元件-1（LINE-1）：一种在大多数哺乳动物基因组中仍具有活性和转座能力的逆转录转座子。
巨噬细胞冠状结构：围绕死亡或垂死的脂肪细胞的巨噬细胞簇。
标志物优先级：根据特定的标准，如特异性、敏感性、易测量性和临床实用性，对潜在标志物进行选择和排序的过程。
癌基因诱导的衰老：由某些癌基因（如RAS）的激活引发的细胞衰老状态。
复制性衰老：由细胞分裂时端粒逐渐缩短引起的一种细胞衰老。
衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）：溶酶体活性增加的标志。
衰老相关卫星膨胀（SADS）：在衰老细胞中观察到，由于染色质重排导致着丝粒区域完整性的丧失。
衰老相关的异染色灶（SAHF）：在培养的衰老细胞中观察到DAPI密集簇，特别是在癌基因诱导的衰老中；代表大规模异染色质形成。
衰老相关分泌表型（SASP）：指促炎细胞因子、生长因子、趋化因子和蛋白酶等生物活性分子的分泌。
衰老细胞：永久退出细胞周期的细胞，通常是由于DNA损伤的累积。
合胞体结：胎盘合体滋养层特化的特点是细胞核的显著积累和染色质的高度浓缩；这通常是人类妊娠32周后滋养细胞成熟和老化的标志。
结论，知识差距和未来方向
根据已发表的人类和小鼠研究的信息，研究团队概述了目前关于多种组织特异性衰老标志物的知识，也指出了对这些标志物的理解的差距。为了弥补这些差距，建议在实践中结合新开发的衰老特征（方框3），采用包含多个衰老特征（方框2）的多种标志物，从而实现对组织内衰老细胞的准确识别。
经过验证的衰老生物标志物的开发代表了在理解发育阶段、衰老和各种疾病的细胞衰老方面取得的重要进展。这些生物标志物不仅有助于识别衰老细胞内潜在的治疗靶点，还有助于监测衰老细胞的清除（方框4）。尽管某些标志物可能与成熟的衰老相关特征（如SASP、DNA损伤和炎症）有相似之处，但它们的全面分类仍在进行中。
衰老标志物与炎症或纤维化相关的条件或实验模型重叠，这是一个重大的研究挑战。这种重叠使因果关系的确定变得复杂，因为这些标志物的存在可能意味着同时发生的各种生物过程（方框1）。SenNet联盟的多模式尝试旨在查明新的特定衰老标志物，帮助将它们与衰老过程中可能发生的其它类型的细胞变化区分开来。为了实现这一目标，SenNet联盟部署了高内涵、高通量的单细胞和空间组学技术，这些技术加速了衰老和疾病研究进展所需的关键衰老生物标志物的发现（方框5）。此外，创新的机器学习和人工智能技术正在开发中，以根据形态学差异区分衰老细胞和非衰老细胞（方框3）。这些无偏倚的方法，再加上转基因模式生物和先进成像平台的使用，在不久的将来，人们对细胞衰老的理解会有很大的提高。
尽管该文章对现有文献进行了全面的搜索，但仍有局限性。具体地说，文章集中讨论了衰老标志物在个体组织中用于衰老细胞的鉴定。建议读者参考更多综述文章，包括细胞衰老、转移性癌症和内分泌疾病之间的联系，以及对衰老的研究现状。
研究团队预计SenNet联盟以及更多的细胞衰老研究团体使用空间映射技术产生的结果将大大促进对各种细胞类型衰老多样性及其在衰老和疾病中的功能影响的理解。本文的主要目标是根据组织中衰老标志物的现有证据，为空间映射组的可靠发展奠定基础。以组织为中心的方法反映了在研究单个组织时设计具有有限数量标记物的空间映射组的实际必要性。鉴于低复用实验技术的持续广泛使用，这一目标至关重要。与该专家建议相关的数据库将作为动态文档，SenNet联盟将定期更新，纳入来自联盟内外的新发现。本文档可从 https://docs.sennetconsortium.org/biomarkers/获取并定期更新，还提供了衰老标志物数据库的交互式图形可视化界面。研究团队预计，随着数据库信息的发展，在不同组织中使用特定标记物的指南将根据新的发现进行更新。
方框4：使用细胞衰老循环标志物的建议
从疾病发现到疾病治疗策略，循环生物标志物为临床工具箱提供了一系列强大的工具。尤其是基于血液的生物标志物，以最小的侵入性提供了易于重复采集和相对较大体积的主要临床优势。为了将抗衰疗法转化到临床，细胞衰老负担的可靠循环生物标志物将是至关重要的，以便确定从去除衰老细胞中受益最多的个体，并在临床试验中跟踪干预的有效性。血液中存在几种类型的生物标志物，包括血浆和血清中的可溶性因子以及免疫系统的循环细胞。研究人员在下文讨论了在这些循环成分中发现衰老标志物的现状，以及开发组织衰老负担的真正特异和敏感的生物标志物所需做的工作。
在衰老和年龄相关疾病中发现的许多可溶性循环因子与众所周知的衰老相关分泌表型（SASP）因子有相似之处。它们是否由衰老细胞驱动仍不确定。大多数提出的循环生物标志物最初是细胞培养中报告的SASP因子，随后在与衰老细胞负担增加相关的条件下引入体内衰老特征，如衰老、与年龄相关的疾病和相关的临床结果：多重疾病、死亡率、活动能力和更年期。值得注意的是，在多项研究中，GDF15、CST3、IGFBP2、TIMP1、TIMP2、STC1、CCL1、INHBA等蛋白与衰老相关问题密切相关。所提出的脂质生物标志物包括生物活性脂质，如白三烯和15-脱氧-Δ-12，14-前列腺素J2。循环生物标志物的其它潜在来源仍有待在体内详细探索，包括衰老相关的胞外囊泡（SASP的另一种生物活性成分）和衰老的循环淋巴细胞。
由于SASP的异质性和识别分泌到血液中的分子来源的挑战，目前仍有许多工作要做以验证衰老负担的循环生物标志物。经过验证的衰老生物标志物理想状态下应满足几个标准，最重要的是与组织衰老负担和衰老细胞去除后的减少相关，但迄今为止很少有研究对其进行探讨。
基于血液的循环生物标志物有可能为临床工具箱提供强大的资源，用于监测健康状况、促进疾病发现和指导治疗策略。然而，这些生物标志物的水平可能会受到最近食物或药物摄入的影响，这使得动物实验成为比人类研究更受控制的研究模型。
方框5：鉴定和表征衰老细胞的技术建议
对可用于研究组织中衰老细胞的技术的全面描述超出了本专家建议的范围，研究人员请读者参阅美国国立卫生研究院（NIH）细胞衰老网络（SenNet）成像工作组最近撰写的一篇综述。在这里，研究人员将讨论局限于已建立的和新颖的大类实验技术，以及如何将其应用于鉴定衰老细胞。
三个因素指导选择哪种技术最适合研究组织中的衰老细胞：衰老细胞在组织中很罕见（占所有细胞的5-10%），因此其鉴定和表征需要单细胞方法；由于其异质性，检测多种衰老特征的标志物需要使用多模态和高复用的技术，这些标志物可能因不同的细胞类型和环境而异；为了正确地捕捉衰老细胞对其微环境的影响，需要使用空间技术。大多数现有的单细胞空间方法依赖于低复用成像技术，如传统的免疫荧光和免疫组织化学（IHC, Immunohistochemistry），其可以在同一细胞中同时成像非常有限数量的标志物（通常为三个或四个）。研究人员建议使用更高复用的最新一代免疫染色技术，如迭代间接免疫荧光成像（4i）（~80复用）和索引共检测（CODEX, Co-detection by indexing）（>100复用），以基于组织中衰老细胞的蛋白质组学图谱来捕捉其异质性。
新兴的空间转录组学技术和商业平台现在可以探测成百上千个基因，如多重误差鲁棒荧光原位杂交（MERFISH, Multiplexed error-robust fluorescence in situ hybridization）301（~500复用）、10× Xenium（~400复用）和Nanostring CosMx（~1000复用），并且可以结合转录组学和蛋白质组学，尽管目前可以检测的蛋白质数量非常有限。
因为这些技术使用预先选择的一组基因和/或蛋白质，所以应该仔细设计用于既定组织的适当标志物集。该集合应包括基于组织中已知细胞类型的细胞类型标志物和拥有大多数衰老特征的衰老标志物。对所研究组织的特异性的衰老标记物（例如，SASP因子）的先前的知识可用于设计更具特异性的标志物集。
目前用于通过单细胞转录组学研究衰老的主要技术是10× Genomics Chromium及其最新一代控制器。尽管这项技术依赖于组织解离，无法捕捉衰老细胞的微环境，但测量转录组可以全面了解衰老细胞的转录变化和异质性。其应用于衰老细胞研究的局限性之一是难以探测CDKN2A（编码p16INK4A）。CDKN2A的表达水平较低，这通常导致高达50%的基因缺失率。因此，不建议使用这些单细胞转录组学检测方法的时候仅依赖CDKN2A在组织中定量衰老细胞的丰度，因为这样做会导致相当多的假阴性。这个问题可以通过使用方框3中描述的基于衰老特征的方法来克服。
