成都大学杨轶浠/卢秋霞团队揭示葫芦素B通过Nrf2途径改善对乙酰氨基酚诱导的线粒体氧化应激反应

随着时间的推移，药物性肝损伤（DILI）已成为导致人类肝损伤的一个主要因素。在美国，一半以上的急性肝损伤是由于错误用药引起的。对乙酰氨基酚（APAP）是著名的解热镇痛药，在临床上应用广泛。正常剂量的对乙酰氨基酚对人体是安全的，但过量服用会导致急性肝损伤。在推荐剂量下，85-90%的APAP会与磺基转移酶（SULT）和UDP-葡萄糖醛酸基转移酶（UGT）结合，产生一种无毒分子，并随尿液排出体外。在正常情况下，NAPQI会与细胞中的谷胱甘肽（GSH）结合，形成无毒的代谢物NAPQI-GSH，从而解毒。然而，当NAPQI残留时，NAPQI会与细胞中的其他蛋白质结合并破坏其功能，从而导致氧化应激、DNA断裂、细胞钙水平升高和线粒体功能失常等细胞损伤效应。Nrf2通过与抗氧化反应元件（ARE）结合产生解毒作用。此外，大量基因已被证明是Nrf2的转录靶标，如胱氨酸/谷氨酸转运体Xct（SLC7A11）和谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）的亚基。

20世纪70年代，N-乙酰半胱氨酸（NAC）被证明在治疗APAP中毒方面具有巨大潜力。解毒机制是补充GSH，从而减少肝脏中的活性氧（ROS）和氧化应激。NAC在首次使用50多年后，仍是治疗APAP过量的首选药物。然而，由于NAC的治疗窗口期有限，它对APAP过量的晚期患者无效。此外，有些患者可能不会经历NAC解毒过程，这增加了产生负面副作用的风险。因此，必须找到一种比NAC更合适的替代品来缓解对乙酰氨基酚诱发的肝损伤（AILI）。

最新研究表明，由于天然物质具有多成分、多靶点、多环节的综合活性，因此在预防和治疗AILI方面具有一定的益处。早期的研究表明，CuB具有一系列药理作用，包括抗氧化、抗病毒、保肝和抗纤维化，这些特性在预防和治疗糖尿病、神经退行性疾病和炎症性疾病等多种疾病方面发挥着重要作用。CuB可提高Nrf2/ARE通路的活性，上调血红素加氧酶1(HO-1)和NAD(P)H醌氧化还原酶1(NQO1)，并抑制Caspase的活性，从而发挥重要的神经保护作用。

众所周知，APAP引起的AILI可通过减少ROS得到缓解，而CuB的重要治疗机制之一就是抗氧化。因此，我们希望探索CuB是否能通过其抗氧化作用治疗AILI。因此，本研究利用网络药理学方法，预测了CuB治疗DIL的可能靶点。此外，研究还验证了CuB在体外通过Nrf2相关途径缓解APAP诱导的肝细胞氧化应激。

我们在Superpred数据库和Pharmmapper数据库中筛选了365个潜在的CuB靶点，并在GeneCards、DisGENET和OMIM数据库中进行了筛选，确定了2570个与DILI相关的靶点。经过交叉分析，共发现了202个共同靶点（图1A，1B）。在STRING数据库中建立了大于0.4的置信度，并构建了蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络图来说明靶标之间的相互作用（图1C）。

图1 CuB治疗药物性肝损伤的靶向筛选

GO图谱从生物过程、细胞成分和分子功能等方面评估了靶标的共同生物功能（图2A）。KEGG富集分析表明，CuB与ROS、癌症、细胞色素P450代谢异种生物等途径密切相关，这可能是CuB治疗DILI的主要作用途径（图2B）。最后，总结了药物-靶标-疾病网络图（图2C）。

图2 GO和KEGG分析

在实验中，建立了受APAP损伤的BRL-3A细胞模型（图3B），通过比较细胞活性，确定后续实验使用30mMAPAP。同时，在CuB（C32H46O8；MW：558.703；CAS：6199-67-3；图3A）对BRL-3A的细胞毒性实验中，CCK8结果显示当CuB低于50nM时，对细胞无毒性（图3C），因此我们在后续实验中使用了12.5nM、25nM和50nM三种浓度的CuB。确定药物浓度后，我们使用钙黄绿素-AM和PI双染色试剂检测细胞的活力和毒性，并判断CuB的保护作用。钙黄绿素-AM进入细胞后会被内源性酯酶水解，并发出绿色荧光。结果显示，APAP组的荧光强度明显降低，表明细胞活力下降。然而，当CuB浓度增加时，细胞活力逐渐恢复并呈剂量依赖性增加（图3D，3E）。同时，PI不能穿透正常细胞膜，只能对死细胞染色，从而反映细胞毒性。图3F和3G显示，随着CuB浓度的增加，PI阳性面积逐渐减少，说明细胞毒性逐渐减弱，活力逐渐恢复。

图3 CuB对APAP诱导的BRL-3A细胞活性的影响

由于APAP代谢消耗GSH并产生活性氧，因此我们检查了细胞内活性氧水平。DCFH-DA染色的结果表明，APAP处理大大提高了细胞内的活性氧水平，而CuB处理降低了细胞内的活性氧水平（图4A，4B）。AST和ALT水平被认为是评估肝细胞损伤的最可靠指标。应用APAP损伤条件后，细胞培养物上清中ALT和AST水平较高，但CuB成功降低了ALT和AST的含量（图4C，4D）。APAP诱导的细胞GSH水平下降（图4E），CuB治疗缓解了这种趋势。此外，我们还检测了MDA水平。结果表明，APAP可以诱导MDA水平上升，而CuB可以明显降低这一指标（图4F）。

图4 CuB对APAP诱导的BRL-3A细胞肝损伤的影响

当细胞发生氧化应激时，会导致线粒体损伤和功能障碍。因此，我们想进一步研究CuB是否可以减轻细胞内线粒体损伤。我们使用JC-1和MitoPeDPP染色检查了线粒体膜电位和线粒体脂质活性氧的变化。通过比较红色荧光和绿色荧光的相对比例，发现APAP组下降，与APAP组相比，CuB组的红色荧光恢复（图5A，5B），表明CuB有效恢复了细胞的线粒体膜电位。如图5C、5D所示，CuB可以有效降低APAP诱导的脂质活性氧。JNK通路对于控制生物体的氧化应激反应至关重要。因此，我们检测了JNK蛋白水平，用APAP诱导后，p-JNK蛋白水平升高，CuB成功降低了p-JNK水平（图5E，5F）。

图5 CuB减轻APAP诱导的BRL-3A细胞线粒体损伤

在确定CuB缓解氧化应激的基础上，进一步探讨CuB对APAP诱导BRL-3A细胞损伤的防御机制。APAP组的SLC7A11和GPX4蛋白水平下降，而CuB则促进两种蛋白质的表达（图6A，6B）。这表明CuB增强了细胞的抗氧化作用。RT-qPCR实验表明，与APAP组相比，CuB组可以有效提高SLC7A11和GPX4的mRNA水平（图6E，6F）。HO-1可以保护细胞免受氧化应激损伤，而NQO1可以将细胞内REDOX产物转化为相应的代谢物。因此，分析了HO-1和NQO1的蛋白表达水平，结果表明CuB上调了它们的蛋白表达（图6C，6D）以及它们的mRNA水平（图6G，6H）。表明CuB可以减轻细胞的氧化应激。

图6 CuB增强BRL-3A细胞的抗氧化作用

Nrf2是HO-1和NQO1的上游调节因子，因此我们研究了CuB对Nrf2蛋白表达和转录水平的影响。CuB上调了Nrf2在细胞核中的表达（图7A，7B），我们通过实时定量聚合酶链反应进一步验证了这一点（图7C，7D）。APAP代谢产物会导致溶酶体中的Fe²⁺泄漏，我们想知道CuB是否能改善这种趋势。图7E显示，APAP可造成溶酶体损伤，导致铁离子外流。CuB可以缓解这一现象，细胞内的Fe²⁺含量恢复正常（图7G，7H）。

图7 CuB通过促进Nrf2转位到细胞核以抑制氧化应激

在本研究中，我们通过腹腔注射APAP（300mg/kg）建立了小鼠肝损伤模型（图8A），并发现CuB可有效逆转AILI，这体现在对血清AST和ALT活性的抑制上（图8B，8C）。接着，我们对肝组织进行了HE染色，结果显示APAP组肝细胞坏死发生在中央静脉周围，炎性细胞浸润到损伤区域，而CuB能有效地恢复这一现象（图8C，8D）。这些数据表明，CuB也能减轻APAP在体内引起的急性肝损伤。

图8 CuB减轻APAP引起的肝损伤

综上所述，本研究表明，CuB具有保护活性，可减轻APAP在体外和体内诱发的肝损伤。CuB通过调节Nrf2通路抑制APAP诱导的BRL-3A细胞DNA损伤，可能成为治疗AILI的候选药物。

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