Network pharmacology and experimental validation to reveal the anti-hepatitis B virus pharmacological mechanism of Phyllanthus urinaria L.
01
文章亮点
本研究主要运用网络药理学探索叶下珠的作用靶点，预测其可能的分子机制，多层次分析叶下珠抗乙型肝炎的作用机制，并验证网络药理学的预测结果，以便为后续治疗乙型肝炎的研究提供参考，并为叶下珠的临床应用提供更全面、更有力的理论支持。
引用信息：
Peng Q, Fu QJ, Xiao M, Sang SG, Rong H. Network pharmacology and experimental validation to reveal the anti-hepatitis B virus pharmacological mechanism of Phyllanthus urinaria L. Tradit Med Res. 2023;8(12):68. doi:10.53388/TMR20230513001
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研究背景
乙型肝炎病毒（HBV）是一种具有血友病特性的DNA病毒。HBV感染是全球最常见的病毒感染之一。HBV感染后疾病进展复杂且多变，受感染个体的年龄、病毒复制和免疫状态等多因素影响。自1981年以来，安全有效的乙肝疫苗在预防HBV感染方面取得了良好的成功，但仍有许多人感染HBV并罹患由该病毒引起的严重疾病。因此，乙肝的治疗仍然是人类面临的重大挑战。目前，治疗乙肝的主要药物是干扰素和核苷类似物，但这些药物都有局限性，例如副作用显著或需要长期服药。因此，迫切需要开发出新的药物治疗或辅助疗法。
叶下珠是大戟科叶下珠属的一种草本植物。据报道，叶下珠含有的主要化合物类型包括类黄酮、单宁、香豆素、木酚素、酚酸等。相关实验表明，叶下珠具有抗病毒、抗肿瘤、保肝、抗氧化、抗炎和抗菌作用。由此，叶下珠的作用机制也非常多样化。在中国，运用中医治疗乙肝已十分广泛，包括单独使用中药制剂或与干扰素和核苷类似物联合使用。多项研究表明，叶下珠对乙肝有显著疗效，但其确切的作用机制尚不完全清楚。在这项研究中，使用网络药理学探索了叶下珠的主要成分并预测了抗乙肝的可能分子机制，为日后使用叶下珠治疗乙肝的研究提供了参考。
03
研究结果
活性成分及相关靶点
首先，通过网络药理学，从草药数据库中获取了叶下珠中研究较频繁的9种化学成分和64个相关靶点。随后，将“乙型肝炎”作为关键词，从OMIM、Herb和GeneCards数据库中获取了与疾病相关的靶点。在移除重复的靶点后，共获得12672个与乙型肝炎疾病相关的靶标（图1）。通过绘制Venn图（图2），乙型肝炎疾病靶点和药物靶点取交集，最终获得了51个共有靶点。
图1 乙型肝炎疾病靶点的Venn分析
图2 叶下珠靶点和乙型肝炎疾病靶点的Venn分析
构建PPI网络与核心靶点
将交集靶点导入STRING数据库，去除游离节点后，获取相互作用网络并保存文件，然后利用Cytoscape 3.8.2软件构建PPI网络图，网络中共包含50个节点和308项相互作用，如图3所示。关键靶点的筛选依据degree值进行：degree值越高，节点越大。
图3 蛋白质网络相互作用示意图
信号通路和功能富集分析
将叶下珠与乙型肝炎的共有靶点导入到DAVID数据库中进行富集分析，以P < 0.05作为蛋白生物功能的显著反应标准。共鉴定出1046个生物过程，包括对活性氧的响应、对脂多糖的响应和对细菌源性分子的响应等。在细胞组分中鉴定出22个信号通路，涉及膜区域、膜微区、膜筏等；在分子功能中鉴定出63个信号通路，涉及核受体活性、谷胱甘肽结合等，如图4所示。KEGG富集的相关信号通路包括流体剪切应力与动脉粥样硬化、乙型肝炎、TNF信号通路、VEGF信号通路、肝细胞癌和JAK-STAT信号通路，具体结果显示在图5。
图4 GO功能富集分析直方图
图5 KEGG通路富集气泡图
叶下珠对乙肝细胞的毒性测试
使用CCK8确定对细胞无显著毒性的药物浓度范围，如图6所示。结果显示250 μg/mL的药物浓度对细胞存活有显著影响，且差异具有统计学意义。
图6 CCK8试验中的细胞存活率
叶下珠抗乙型肝炎的效果
在安全浓度范围内，对HepG2.2.15细胞采用不同浓度的叶下珠提取物处理后，测量了上清液中乙肝表面抗原（HBsAg）、乙肝e抗原（HBeAg）和HBV DNA水平，发现叶下珠对HBsAg、HBeAg、HBV DNA的水平具有显著的抑制作用，并且呈浓度依赖性和时间依赖性，如图7所示。因此，这表明叶下珠对乙型肝炎具有良好的治疗效果，并为后续实验的可行性提供了真实可靠的依据。
图7 相同药物浓度下作用于细胞24小时与48小时后，上清液中HBsAg、HBeAg分泌和HBV DNA水平的比较
调控NFE2L2/HMOX1信号轴
通过监测PCR过程中的荧光强度，使用qPCR比较样本之间的基因表达。经过药物处理后，通过qPCR检测目标基因NFE2L2、HMOX1的表达。结果发现，NFE2L2和HMOX1的表达显著提高。如图8所示，使用WB实验分析NFE2L2、HMOX1蛋白的表达。与空白对照组相比，叶下珠给药后，细胞中NFE2L2和HMOX1蛋白的表达水平升高，且差异具有统计学意义。具体结果显示在图9。
图8 叶下珠处理后靶基因NFE2L2和HMOX1的mRNA表达
图9 药物作用后靶蛋白NFE2L2和HMOX1的表达
04
结论
本研究通过网络药理学分析和体外实验验证，探讨了叶下珠抗乙型肝炎病毒的药理机制。网络药理学分析预测，叶下珠通过调节多个成分、靶点和通路来发挥其抗HBV的治疗作用。体外实验确认了叶下珠通过调控NFE2L2/HMOX1信号轴发挥抗氧化作用，进而影响乙型肝炎的进展。这为叶下珠的临床应用提供了理论依据，也为进一步的研究奠定了基础。
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