Unraveling the mechanism of action of Shangxia Liangji formula for treating insomnia: a metabolomics and network pharmacology approach
01
文章亮点
代谢组学分析揭示了上下两济丹（SXLJF）治疗失眠中涉及的48种潜在重要代谢物和2个关键代谢通路。网络药理学分析确定了352个与SXLJF相关的潜在靶点和122个重要信号通路，为进一步研究SXLJF的作用机制提供了线索。代谢组学与网络药理学的综合分析结果表明，酪氨酸羟化酶和酪氨酸代谢分别是使用SXLJF治疗失眠的关键靶点和相关代谢途径。
引用信息：
Quan XJ, Liang H, Tang YH, et al. Unraveling the mechanism of action of Shangxia Liangji formula for treating insomnia: a metabolomics and network pharmacology approach. Tradit Med Res. 2025;10(2):8. doi:10.53388/TMR20240513002
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研究背景
失眠是一种常见的睡眠障碍，表现为难以入睡、易醒或早醒等症状，严重影响患者的日常生活和工作。因此，寻找有效的治疗方法对失眠患者非常重要。中药复方上下两济丹（SXLJF）是古典《辨证录》记录的一种常用于治疗失眠的中草药制剂。本文旨在探究SXLJF是否可以作为一种治疗失眠的有效方法，并探索其作用机制。研究采用了行为学测试、代谢组学分析和网络药理学分析等方法联合分析来评估SXLJF的疗效和作用机制。
03
研究方法
将42只雄性SPF级昆明小鼠随机分为对照组（n=10）和模型组（n=32），腹腔注射PCPA（300 mg/kg），连续两天，随机观察对照组（n=5）和模型组（n=5）小鼠血清5-HT变化，确定失眠模型成功建立（图1）。然后将模型组再随机分为模型组（n=8）、SXLJF组（n=8，18.72 g/kg/day）和阳性对照组（地西泮，n=8，2 mg/kg）。灌胃给药，连续7天。旷场实验和戊巴比妥钠睡眠实验行小鼠行为学分析，血清代谢组学和网络药理学联合分析探索SXLJF治疗失眠的潜在靶点，利用RT-qPCR验证关键靶点。
图1 与对照组相比，小鼠血清中的5-HT含量
04
研究结果
行为学实验
采用了旷场实验和戊巴比妥钠睡眠实验来验证SXLJF的抗失眠效果。结果显示（图2），与模型组相比，SXLJF组的总移动距离、平均速度和中心移动距离都显著降低，睡眠潜伏期明显缩短，睡眠持续时间明显延长。这些发现表明SXLJF能够改善失眠症状。
图2 上下两济丹对行为实验的影响
血清代谢组学分析
使用无监督的PCA模型来评估消极对照组（NC）、模型组（MG）、SXLJF组和地西泮组（DZP）的代谢趋势。3D-PCA得分图显示QC样品紧密聚集，并且不同组别（图3A, 3B）之间的血清样品显示出明显的分离趋势，表明存在许多差异表达的代谢物。对小鼠血清样品进行了PLS-DA分析。在两种离子模式下，MG、NC、SXLJF和DZP组都表现出显著的聚类（图3C, 3D），这表明组间差异比个体差异更为显著。在两种离子模式下，MG与NC组之间能够显著区分，表明建模后代谢发生了显著变化。利用OPLS-DA对MG与NC组以及SXLJF组与MG的代谢组学数据进行了分析。结果显示了这两对组间的明显分离（图3E–3H）。使用置换检验（n=200）来评估OPLS-DA模型的准确性。结果显示左侧的R2和Q2值低于对应的右侧初始值，特别是Q2回归线的截距为负值（图3I, 3J）。
图3 代谢组学结果的多变量和整体统计分析
为了筛选与SXLJF治疗效果相关的潜在生物标志物，对与NC组以及模型组与SXLJF组之间的差异代谢物（DMs）进行了维恩图分析。在正离子模式和负离子模式下，分别获得了31个和17个交集代谢物（图4A, 4B）。这些代谢物在接受治疗后发生了逆转，并被认为是SXLJF治疗的目标。将这些差异代谢物上传到MetaboAnalyst 5.0进行代谢通路分析，以进一步研究SXLJF改善失眠的潜在机制，鉴定出了两个关键的目标代谢通路：苯丙氨酸-酪氨酸-色氨酸生物合成途径和甘油磷脂代谢（图4C）。
图4 潜在生物标志物筛选和代谢通路分析
网络药理学分析
BATMAN数据库的查询结果中去除重复项后，从SXLJF中的六种草药中筛选出了166种化合物。构建药物-化合物-靶点网络由1846个节点（6种草药、166种活性化合物和1674个化合物靶点）和7283条边组成（图5A）。从GeneCards和OMIM两个数据库中筛选出失眠相关的潜在靶基因，并去重后获得了5846个靶点。使用维恩图分析了SXLJF的靶点与失眠靶点之间的交集。鉴定出352个潜在靶点（图5B）。将352个交集靶点输入STRING数据库构建了一个PPI网络，该网络包含352个节点和3653条边（图5C）。并按度排序前15位的节点（图5D）。将352个靶点进行了GO和KEGG通路分析，根据富集因子选择了每种方法排名前五的条目（图5E），排名前15的KEGG通路（图5F）。
图5 网络药理学分析
血清代谢组学和网络药理学联合分析
构建了一个整合了血清代谢组学和网络药理学的交互网络。将从MG与NC组以及SXLJF组与MG之间重叠得到的差异代谢物导入到MetScape中，并构建了CREG网络（图6）。通过将网络药理学分析得出的前15个潜在靶点与通过MetScape分析确定的基因相关联，结果表明酪氨酸羟化酶（TH）是关键靶点，酪氨酸是相关的关键代谢物，而酪氨酸代谢是相关的代谢途径。
图6 关键代谢物和靶点的CREG网络
RT-qPCR检测TH mRNA
在模型组中，TH mRNA的表达显著高于对照组（P < 0.01）。此外，与模型组相比，SXLJF组中的TH mRNA表达显著降低（P < 0.01）（图7）。
图7 上下两济丹对小鼠脑中TH mRNA表达的影响
05
结论
本研究采用了一种整合了代谢组学、网络药理学和实验验证的综合策略，来确定SXLJF的治疗效果，并进一步探讨其在失眠治疗中的潜在机制。实验结果表明SXLJF具有抗失眠作用。综合分析发现TH可能是关键靶点，而酪氨酸代谢是一个潜在的关键相关代谢途径，这可能是SXLJF治疗失眠的一个潜在机制。
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