Integrated UHPLC-MS and network pharmacology to explore the active constituents and pharmacological mechanisms of Shenzao dripping pills against coronary heart disease
01
文章亮点
通过液相色谱和质谱技术，首次在大鼠血浆中鉴定出参枣滴丸的13种主要活性成分。
通过网络药理学和分子对接技术，首次研究了参枣滴丸治疗冠心病的药理机制。
引用信息：
Hu T, Zheng KN, Liang JY, et al. Integrated UHPLC-MS and network pharmacology to explore the active constituents and pharmacological mechanisms of Shenzao dripping pills against coronary heart disease. Tradit Med Res. 2022;7(3):24. doi:10.53388/TMR20220308267
02
研究背景
冠心病是一种多因素疾病，其特征是动脉发生粥样硬化，导致心肌缺血、缺氧和坏死。它具有高发病率、高复发率和高死亡率，对人类生命构成着极大威胁。尽管化学合成药物占据了当代冠心病治疗的绝大部分，但随之引发的不良药物反应是一个相当大的风险。传统中药治疗冠心病的疗效已被长期认可。传统中药与化学制药的不同之处在于，前者含有多种活性成分，以及多种药理途径。在预防、治疗和康复心脏病方面，它提供了众多优势。然而，由于不同化合物之间的相互作用，传统中药的成分复杂，导致很难完全解释中药的活性成分和药理机制。
参枣滴丸（SZDP）综合了苏合香丸和复方丹参方，并增加了降香和南酸枣。研究团队将其制成滴丸，提高了药物的生物利用率，便于携带和服用。此外，参枣滴丸中有六种草药的部分活性成分已被报道可治疗冠心病。然而，这些研究只能反映参枣滴丸的部分化学成分，还不够全面。参枣滴丸的活性成分和药理作用仍然未知。因此，通过利用LC-MS、网络药理学和分子对接技术，本研究全面调查了参枣滴丸的化学组成和潜在的药理作用，得出了鉴定中药物质和药理作用的可靠分析策略。
03
研究结果
鉴定参枣滴丸的原型成分
参枣滴丸的正负基峰强度电流图如图1所示。推断出参枣滴丸含有72种化学成分。此外，本文展示了几种典型的化合物（包括丹参酮、酚酸、人参皂苷和有机酸）的鉴定方法（图2）。
图1 参枣滴丸基峰强度色谱图
图2 参枣滴丸中典型化合物的裂解途径分析
鉴定血浆中参枣滴丸的化学成分
通过在多个时间点对SZDP组血液的调查，研究人员发现中药给药后1小时血浆中出现的物质最多。因此，采血的时间框架被定为1小时。收集大鼠血浆后，使用LC-MS进行分析。将SZDP组的血浆成分与参考物质进行比较，并使用数据库进行验证，进而分析了SZDP组的化学成分。结果共发现了33种化合物，包括24种代谢物和9种原型成分。
鉴定血浆中参枣滴丸的代谢成分
发现化合物24的分子离子峰[M−H]−m/z 343.1405，其MS2碎片m/z 175.0242、m/z 167.1071、m/z 113.0234、m/z 85.0283，其中MS2碎片m/z 175.0242和m/z 113.0234是葡萄糖醛酸基团的特征离子碎片。推测m/z 167.1071为香草酸，即原儿茶酸的甲基化产物。因此，推测化合物24为香草酸-葡萄糖醛酸的代谢物。
代谢物6的分子离子峰[M−H]−为246.9920，其MS2碎片m/z 203.0112和m/z 167.0343，其中m/z 167.0343是原儿茶酸的甲基化产物——香草酸的离子峰。因此，推测化合物6为香草酸-磺酸的代谢物。
化合物13的分子离子峰[M−H]− m/z 477.1049，MS2碎片m/z 301.0723，查询数据库后确认为槲皮素-葡萄糖酸的代谢物。
化合物12、14、15、16、17是葡萄糖醛酸轭合物，因为它们的[M−H]−显示出葡萄糖醛酸的特征中性丢失，并生成相当于类黄酮骨架的[Aglycon−H]−。
网络药理学分析
使用TCMSP和TCMIP数据库寻找血浆中24种原型成分的靶点，并通过UniProt数据库对结果进行校正。最终获得150个靶点。从GeneCards、PharmGKB和TCMIP数据库检索到3592个冠心病相关靶点，通过匹配冠心病靶点与参枣滴丸化合物靶点，得到90个重叠靶点（见图3A）。
使用STRING分析比较了90个重叠靶点，并生成了PPI网络（图3B）。PPI网络包含656条边和88个节点。利用CytoNCA插件分析PPI网络的拓扑特性后，发现了26个重要靶点（图3C）。经过第二轮筛选，发现了九个有前景的靶点。通过化合物与靶点的相关性，我们发现了13种关键化合物：人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rc、人参皂苷Rd、人参皂苷Re、原儿茶酸、咖啡酸、阿魏酸、柠檬酸、酪氨酸、没食子酸和樱黄素。
图3 参枣滴丸进入血浆的成分的网络药理学分析图
通过GO和KEGG通路富集分析研究上述共同靶点。GO中总共有1601个生物功能注释，包括1349个生物过程、61个细胞组分和101个分子功能。KGGG通路分析显示了149条通路，包括甲状腺激素信号通路、cGMP-PKG信号通路、雌激素信号通路、IL-17信号通路、VEGF信号通路等。根据KEGG富集分析的结果，选择了前30条通路作为视觉展示的案例（图4）。
将进入血浆的化合物、共同靶点、前十个KEGG通路、疾病和中药导入到Cytoscape软件中，构建了一个“中药–成分–靶点–通路–疾病”网络（图3D）。这个图中可以看到“多成分、多靶点、多途径”的协同效应，表明参枣滴丸化合物正在干扰冠心病。
图4 GO和KEGG通路的富集分析
分子对接验证
借助分子对接技术研究9个关键靶点和13种关键化合物之间的相互作用程度。使用SYBYL软件计算对接亲和力的总分。分数越高，对接亲和力越强。SRC、PTGS2、ESR1、NR3C1、AKT1、TNF和caspase-3与其相应分子的高对接分数表明，化合物可能通过这些靶点发挥作用。使用PyMOL程序，得出了上述分子的分子对接数据。
图5 分子对接结果
04
结论
本研究结合了LC-MS、网络药理学和分子对接三种技术，揭示了参枣滴丸的主要活性成分，并对参枣滴丸在治疗冠心病中的主要药理作用进行了预测。参枣滴丸主要通过人参皂苷和阿魏酸影响雌激素、IL-17和VEGF信号通路，从而对冠心病产生一定的治疗效果。
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