【一分钟秒懂要点】
1. 移植后易发生病毒、细菌以及真菌感染，患者可能会出现浑身不适，发热，头晕，休克甚至死亡的现象，因此早检查，早干预至关重要。
2. 目前常用的传统检测方法有测序技术和PCR等技术。然而这些技术存在灵敏度与特异性不够高、检测成本高、耗时、需要昂贵仪器等缺陷而难以达到快速灵敏以及多重检测。
3. 本研究提出了一个超灵敏（单拷贝范围，~aM）和快速（40分钟内）的等温单管RNA检测平台，应用于病毒和细菌感染的快速检测，并且该方法能识别单核苷酸多态性（SNPs），检测0.1%的耐药突变。我们通过检测68例HBV、23例EBV和48例SARS-CoV-2感染患者的生物样本来验证SATCAS，在病毒感染检测中达到100%的灵敏度、92.86%的特异性和97.06%的准确性。
4. 本研究方案在病原感染的早期诊断、亚型分型、耐药检测、护理点监测等方面具有广泛的应用潜力。
5. 文章以Article形式发表于生物传感Top期刊《Biosensors and Bioelectronics》。
通讯作者
张晓辉 教授
主任医师，二级教授，博士生导师
北京大学人民医院血液科
北京大学血液病研究所副所长
国家血液系统疾病临床医学研究中心副主任兼办公室主任
第一作者
王婷 博士后
北京大学人民医院博士后
主要研究领域：
CRISPR/Cas基因编辑技术与基因诊疗
生物分析及生物传感高灵敏新方法的基础理论和应用研究
导师：张晓辉教授
研究背景
在移植后早期，尤其是3个月内容易发生各种各样的感染，最常见的是病毒、细菌、真菌感染，因此早检查，早干预至关重要，迫切需要开发具有高灵敏度，高特异性，多功能性，简单快速的适用于护理点（POC）检测的新方法。目前, 核酸检测一般包括病原体的分离，核酸提取与扩增，检测结果分析等，耗时长且依赖于热循环等医疗设备及专业水平较高的操作人员。现有的传统聚合酶链式反应（PCR）、众多等温扩增和核酸杂交方法，在灵敏度，准确性，抗干扰性和护理点（POC）检测方面都存在缺陷。CRISPR/Cas系统自发现以来因其强大的功能迅速成为研究热点，不仅在基因编辑治疗等方面，在分子诊断领域也成为技术核心。RNA引导的CRISPR/Cas13a系统由于其反式切割活性在分子诊断中显示出巨大的潜力。然而，大多数基于Cas13的检测方法需要一个扩增子转录步骤，并且多步骤的开管操作容易受到污染，限制了它们的广泛应用。
本研究提出了一个超灵敏（单拷贝范围，~aM）和快速（在40分钟内）的等温单管RNA检测平台，称为SATCAS。该方法在总菌落数不变的条件下，能有效区分活病原体（0% ~ 100%），具有稳健性和通用性。SATCAS在识别单核苷酸多态性（SNPs）方面表现出色，特别是检测0.1%的耐药突变。我们通过检测68例HBV、23例EBV和48例SARS-CoV-2感染患者的生物样本来验证SATCAS，在病毒感染检测中达到100%的灵敏度、92.86%的特异性和97.06%的准确性。预计SATCAS在病原感染病的早期诊断、亚型分型、耐药检测、护理点监测等方面具有广泛的应用潜力。
研究过程
1. SATCAS检测平台的设计开发及可行性研究
本研究开发了一种超灵敏、抗干扰能力强的一锅式视觉核酸分析方法，适用于移植后病原体感染检测和临床诊断。将同步扩增检测（SAT）与CRISPR/Cas13a结合起来，引入Cas13a作为SAT的扩增报告工具，构建了名为SATCAS的一锅等温核酸检测平台。SATCAS结合了预扩增、CRISPR-RNA引导配对和Cas13a裂解活性的指数循环，可在40分钟内直接快速检测每个反应接近单拷贝的RNA分子，具有较强的检测不同类型病毒的能力。该方法具有只检测RNA模板而不受DNA干扰的特点，能快速分辨活病原体感染。与单独使用SAT相比，检测时间显著缩短了近半小时，同时保持了与qRT-PCR相当的灵敏度。该方法可与荧光读取器、蓝光灯等简单、便携、经济高效的报告设备集成，便于即时输出结果。这种综合方法消除了对实验室设备的需要，简化了检测过程。综上所述，SATCAS是一种多功能的等温RNA检测诊断技术，具有优异的分析性能和便利性。
2. 灵敏度研究
针对不同的靶标进行了crRNA筛选，并研究了SATCAS在最佳反应条件下的灵敏度。在10-10-10 nM的浓度梯度范围内有效地建立了SATCAS检测目标RNA的灵敏度，实时荧光测量和可视荧光的终点值都显示出明显的强度梯度，在一个反应体系中持续检测到0.1 aM目标核酸，表明分析检测限（LOD）为单拷贝每个体系，与qRT-PCR和LAMP相当，且荧光比（F/F0）与RNA浓度的对数（lg）呈很强的线性关系，验证了SATCAS可用于目标核酸的定性和定量分析。
3. 特异性研究
在基于Cas13的诊断应用中， LwaCas13a对单核苷酸错配具有耐受性，这给区分SNP带来了挑战。一种成功的策略是在关键位置引入一个或多个额外的“合成错配”来实现区分。然而，分辨或合成错配的位置并不直观，需要根据经验确定每个crRNA-目标集的位置，而且并不总是能产生稳健的分辨效果。在此，我们探索了SATCAS基于Cas13a靶向耐药突变位点的特异性。假定Cas13a在所有测试的crRNA 间距长度上都具有恒定的核酸酶活性，我们通过在互补区每隔2个碱基引入一个错配来探索不同crRNA靶向序列对错配的敏感性，研究发现间隔位置M14的靶标突变和位置M4、M7和M19的合成错配表现出相对较高的特异性比率。由此对耐药突变基因掺杂模型进行检测，验证了SATCAS 可以检测到0.1%的突变。
4. 实际样本检测及应用
作为一种潜在的生物医学应用概念验证，我们采用SATCAS方法检测临床样本中的病毒RNA以诊断病毒感染，包括SARS-CoV-2、HBV和EBV感染。为此，我们采集了患者的血液样本，提取了RNA，然后使用一锅SATCAS和两步qRT-PCR进行了平行测定。实验结果表明SATCAS的灵敏度为100%，特异度为92.86%，准确度为97.06%，验证了基于SATCAS的RNA检测平台在病原体感染检测中的应用潜力。
图1 快速RNA检测的SATCAS原理图
图2 SATCAS特异性研究及其在SNPs鉴别中的应用
研究者解析：
本研究开发了针对移植后的病原体感染诊断方法和耐药突变多重检测的生物传感器及装置，该平台40分钟内检测出单拷贝核酸分子及0.1%的耐药突变，通过有效检测患者生物样本，证明了该技术灵敏度为100%，特异性为92.86%，准确度为97.06%。上述高效灵敏、多功能平台在血液系统恶性肿瘤的耐药监测，预后评估和病原体感染的早期诊断中具有重大应用潜力。
原文链接：
Wang T, Bai L, Wang G, Han J, Wu L, Chen X, Zhang H, Feng J, Wang Y, Wang R, Zhang X. SATCAS: A CRISPR/Cas13a-based simultaneous amplification and testing platform for one-pot RNA detection and SNPs distinguish in clinical diagnosis. Biosens Bioelectron. 2024 Nov 1;263:116636. doi: 10.1016/j.bios.2024.116636. Epub 2024 Aug 5. PMID: 39116631.
撰稿：王婷
编辑：韩子琦
校对：高伟豪
审核：刘竞、孔圆
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