一、写在前面
Image J软件是一款功能强大且免费的图片处理软件，其功能强大且小巧方便，深受广大科研工作者的喜爱。之前的文章向大家介绍了如何使用Image J软件对WB条带进行量化，那么此篇文章将主要围绕组织石蜡切片免疫荧光简要介绍如何使用Image J软件进行免疫荧光图片进行分析处理。
之前也有不少同学提及Image J软件从哪里下载的问题，在此一并附上官网下载链接：https://Image J.nih.gov/ij/download.html，倘若不知如何安装的话也可在各大软件安装公众号进行检索，一般都会提供免费的安装包和安装教程，方便快捷。
二、常规应用及注意事项
当我们拿到免疫荧光图片后，通常需要对图片进行一定的处理以使图片符合要求规范，最常用的主要有以下四个方面，需要注意的是免疫荧光半定量分析目前颇受争议，部分专家认为半定量分析时容易受到参数调节和主观因素的影响，因此没有太大意义，而另有部分专家也是对其保持中立或支持的态度，毕竟它只是半定量而非绝对定量。
那在这里还是建议大家投稿时可以先做个半定量分析，再视审稿人态度决定，若审稿人强烈反对，把它去掉即可，但若并未提及这一点，那好歹也可以增加一小部分内容不是？
1. 亮度调节
1)单色图片亮度调节
a.打开Image J软件，点击“File”→“Open”打开待调节的图片，或者直接将图片拖进Image J软件，即可打开图片；
b.点击“Image”→“Adjust”→“Brightness/Contrast”或采用快捷键“Ctrl +Shift+C”→鼠标拖动“Minimum”、“Maximum”、“Brightness”至所需亮度，点击“Apply”，再点击“File”→“Save”或“Save as”保存即可（注意事项：严格把控亮度，切忌调节亮度至过曝）；
c.调节效果展示
d.各单色图片调节完成后，打开各图片，点击“Image”→“Color”→“Merge Channels”，依次选中相应图片，点击“Keep source images”→“OK”，而后保存即可得到合成后的图片。
2)合成后图片亮度调节
a.打开待调节的图片；
b.点击“Image”→“Adjust”→“Color Balance”，选中要调节的颜色，继而拖动“Minimum”、“Maximum”至所需亮度后，再次调节其他颜色，直至调整到较为合适的亮度（注意事项：建议先调整比较弱的颜色，再调较亮的颜色）；
c.调节效果展示
注意事项：就先调节后合成或者直接对合成图片进行调节的两种方式而言，更推荐大家采用第一种。
2. 加标尺
通常情况下，荧光显微镜或共聚焦显微镜自带的摄图软件都有加标尺的功能，按照所需要求进行设置后导出的图片即可自带标尺，但如果忘记添加标尺或者截取了部分图片需要给其添加标尺时，Image J软件就是一个很棒的工具。
a.首先，我们需要找到一张带有标尺的图片，将其导入Image J软件，按住“Ctrl”键，滑动鼠标滚轮放大图片，并定位至标尺所在处。使用线段工具标出已知的标尺长度，点击“Analyze”→“Set Scale”设置标尺长度，我们以50 μm的标尺长度作为演示，所以此处“Known diatance”即为50，“Unit of length”为μm，勾选“Global”后点击“OK”即可；
b.打开待添加标尺的图片，点击“Analyze”→“Tools”→“Scale Bar”，然后就可以对标尺进行各项参数设置，包括标尺大小、颜色、位置等，取消勾选“Overlay”，然后点击“OK”进行保存即可（注意事项：勾选“Overlay”相当于无损添加标尺，即浮于图片上并未添加到图片里，虽然已添加了标尺，但保存后的图片依然是没有的，取消勾选“Overlay”保存后的图片是有标尺的，这便是为何明明添加了标尺保存后却不见标尺的原因所在）。
3. 添加标注
很多情况下通常需要对图片某一部位或某一区域进行标注以突出强调，这也是Image J软件的最常用的基本操作之一，具体操作如下：
a.在Image J软件中打开图片，选择直线工具，点击鼠标右键，选择箭头“Arrow tool”工具，箭头的大小、颜色等双击即可进行设置，设置完成后，用鼠标拖动即可标记；
b.请注意，若直接保存属于无损标记，保存后的图片是看不到标记的，因此，添加完标记后，先点击“Edit”→“Draw”或者直接采用快捷键“Ctrl +D”处理后再进行保存，即可显示标记。
c.效果展示
4. 不同图片截取同一位置
a.在Image J软件中打开所有待截取的图片，点击“矩形”工具对待截取的位置进行简单框选（注意事项：矩形框的大小可以手动拖动，亦可进行长度和宽度的设置以规定其具体大小）；
b.点击“Analyze”→“Tools”→“ROI Manager”→“Add”即可记录所要截取的位置，不要关闭此窗口→点击另一张待截取的图，选中记录的位置编号，即可在另一张图框选中相同位置（注意事项：多张图片同时导入Image J软件一定要注意分清楚目前操作所选中的图片是哪一张，不能混淆，正如我们在此处点击“Add”时处理的图片一定是第一次用矩形框选的图片，而非导入的未经任何处理的图片，否则会报错哦）；
c.倘若想要规定矩形的大小参数再进行截取，则只需点击“More”→“Specify”即可对矩形框的大小进行调整（注意事项：调整后矩形框的位置与原先位置存在差异，继续点击“Add”即时记录现有位置）；
d.点击“Image”→“Crop”，即可截取所需位置，点击保存即可。
e.效果展示
5. 平均荧光强度分析
平均荧光强度分析是免疫荧光半定量分析中的重要一环，得到平均荧光强度后可以根据具体分组等情况按照相应的统计学方法进行半定量分析，关于半定量分析想必大家都比较熟悉，在此不做过多介绍，仅为大家展示平均荧光强度分析的相关内容，具体操作如下（注意事项：单个图片处理与批量处理是相承接的，而非割裂开的，这里只是为了方便大家理解才分为两小点去讲述）：
1)单个图片处理
a.导入待分析的图片，点击“Image”→“Type”→“8-bit”→“Adjust”→“Auto threshold”→“OK”→挑选与原图最为匹配的一张图，按住Ctrl键滑动鼠标滚轮放大即可看到图片名称（不同名称往往代表不同算法），记住其名称（注意事项：此步操作具有极强的主观性，这也是很多专家不认可半定量分析的原因之一哦）；
b.点击“Image”→“Adjust”→“Threshold”→选择刚才图片的名称，亦可再次拖动进度条进行微调；
c.点击“Analyze”→“Set Measurements”→依次选中“Area”、“Mean gray value”、“Integrated density”、“Limit to threshold”（其他选项按需选择）→“OK”→“Analyze”→“Measure”或者使用快捷键“Ctrl + M”即可得到结果；
2)批量图片处理
a.导入图片，点击“Developer Menu”→“Record”→“Image”→“Type”→“8-bit”→“Image”→“Adjust”→“Threshold”→“Analyze”→“Measure”即可得到结果；
b.点击“Create”→依次导入待分析的各图片，并依次点击“Run”即可得到各图片的分析结果。
本文作者是"夏沫梦鸢"同学，在获得授权后，实验老司机将本文发表于公众号。
文稿：夏沫梦鸢
校对：煲仔饭
素材：
https://images.app.goo.gl/8nN8JLGXf3tyYGJv7
https://images.app.goo.gl/DtHymEe5eT6foQLV6
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