厦门大学刘亮教授课题组发现crRNA与tracrRNA引导的Cas9在识别目标核酸后展现出高效的反式切割活性，并以此开发了两款名为DACD（DNA-activated Cas9 Detection）和RACD (RNA-activated Cas9 Detection)的核酸检测工具。研究人员首先通过结构比较发现，当Cas9与sgRNA和target ssDNA组装后，其HNH结构域和RuvC结构域参与形成的通道具备容纳非目标ssDNA的潜力。研究人员因此怀疑可能需要序列和结构特异性的底物与该通道结合才能使Cas9进行反式切割。通过对核酸底物进行筛选发现，体外条件下，target DNA可以激活Cas9-sgRNA复合物反式切割poly T或poly C ssDNA。既往研究表明，采用嵌合的sgRNA替代crRNA-tracrRNA对Cas9顺式切割target DNA不会产生显著影响。然而，在探究sgRNA替代方案是否影响了Cas9的反式切割活性时，研究人员发现，在crRNA-tracrRNA双引导RNA的协助下，Cas9的反式切割活性得到了显著提高。进一步研究发现target ssDNA、target dsDNA和target ssRNA均可有效地激活Cas9反式切割非目标ssDNA或ssRNA底物。通过与核酸扩增技术相结合，DACD和RACD均可在短时间内对含有猴痘病毒B6R基因的质粒实现精准检测，检测极限分别可达到24和2.4 拷贝/微升。另外，在选取的靶序列仅存在单碱基差异的情况下，DACD和RACD成功对来自猴痘病毒刚果毒株和西非毒株的B6R基因实现了差异区分。
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