同源人类胚胎干细胞衍生的类胰岛细胞揭示20个与2型糖尿病相关基因的功能

学术 2024-09-18 16:01 上海

撰文│徐海斌

编辑│毕紫娟

审校│汤红明

【据《Cell Metabolism》2023年10月报道】题：同源人类胚胎干细胞衍生的类胰岛细胞揭示20个与2型糖尿病相关基因的功能（美国国家卫生研究所作者Francis S Collins 等）（原文链接.pdf）

目前已发现多个与2型糖尿病（type 2 diabetes，T2D）相关的基因位点，但其功能尚未完全知晓。研究人员针对20个与T2D风险相关的基因构建了基因敲除的人胚胎干细胞系，并检查每个敲除基因对β细胞分化、功能和存活的影响。研究团队分析了敲除细胞系分化出的β细胞的基因表达和染色质可及性谱。通过分析T2D相关信号与依赖肝细胞核因子4-α（hepatocyte nuclear factor 4-alpha，HNF4A）的染色质可及性检测（assay for transposaseaccessible chromatin，ATAC）峰重叠的部分，确认了Fas细胞凋亡抑制分子2是T2D相关信号可能的致病变异。此外，综合关联分析还发现了与胰岛素产生有关的4个基因（CP、RNASE1、PCSK1N和GSTA2）及β细胞对脂毒性敏感度有关的两个基因（TAGLN3和DHRS2）。最后，研究团队利用深度ATAC-seq读取覆盖率，评估了亲本系中杂合变异位点的等位基因特异性不平衡，并在23个T2D相关信号中鉴定出一个可能的功能性变异。

研究团队在原始人类胰岛β细胞和人类胚胎干细胞（human Embryonic stem cell，hESC）分化来的β细胞中发现均有表达这20个基因。研究人员使用INS^GFP/w MEL1 hESC系生成了等基因敲除（knock out，KO）细胞系，这种细胞系可通过荧光激活细胞分选来分离出表达胰岛素的细胞。对每个T2D基因，研究团队识别出两个等基因克隆（标为#1和#2），它们携带同源或复合杂合的移码突变及功能丧失突变。作为后续分析对照，研究团队选择了两个野生型（wild type，WT）克隆，一个暴露于Cas9但未使用靶向sgRNA，另一个是未暴露的INS^GFP/w MEL1细胞。这两个克隆保留了典型的hESC集落形态，并表达了多能性标志，包括OCT4、SSEA4、NANOG 和TRA-1-81。

随后研究团队将42个hESC系（对照+重复）进行分化，使其类似于胰腺β细胞（hESC-β细胞），并进行了活细胞成像。研究人员观察到在基因KO细胞系中，INS-GFP细胞的荧光表达存在差异，表明与T2D相关的一些基因影响了细胞分化过程。进一步使用流式细胞术对GFP细胞的百分比进行定量，发现COBLL1^-/-、GIPR^-/-、HNF4A^-/-、TCF7L2^-/-、TGFB1^-/-和TLE4^-/-细胞系的分化效率受到损害。

随后，研究团队测量了细胞中与胰岛素相关的3个特性：①胰岛素产生；②葡萄糖刺激的胰岛素分泌（GSIS）；③氯化钾刺激的胰岛素分泌（KSIS）。其中大部分KO 细胞中INS-GFP⁺ hESC-β的胞内总胰岛素含量降低。并且多个KO的hESC胰岛对葡萄糖反应受损，而只有ABCC8^-/-、HNF1A^-/-、HNF4A^-/-、HTT^-/-、KCNJ11^-/-和WDR13^-/-的hESC胰岛对氯化钾刺激的反应显示出胰岛素分泌缺陷。研究团队随后评估了WT和突变型hESC-β的凋亡率，发现WT和KO hESC-β的存活率无差异。然而，在有脂质积累和压力的情况下，大部分KO的hESC-β的凋亡率增加，而SLC30A8^-/-的hESC-β凋亡率减少。总的来说，研究团队发现这20个基因可能通过干扰胰腺β细胞生成、功能和存活影响T2D发生。特别是HNF4A的缺失影响了以上5种与胰岛相关的细胞特性，这暗示了HNF4A在胰腺β细胞的发育和功能中具有特别突出作用。

研究团队为了解上述细胞相比WT组在转录组和染色质可及性上的变化，进行了RNA测序（RNA-seq）和ATAC-seq。发现表达差异基因（differential expression genes，DEGs）的数量相当广泛，从SLC30A8^-/- hESC-β的295个基因到HNF4A^-/- hESC-β的5969个基因。此外，团队评估了DEGs在原发性胰岛β细胞中与其他胰岛细胞类型特异性表达基因的富集情况。在17/20的KO系中，那些高度特异性表达于β细胞的基因在DEGs中被富集，这强调了hESC-β作为原发性胰岛β细胞模型的相关性。通过比较KO系和WT系的ATAC-seq数据，研究团队还鉴定了差异性可及的染色质区域。与DEGs结果一致，HNF4A^-/-显示出最多的差异开放染色质区域（DARs，39 013）。这进一步证实了HNF4A是调控β细胞功能的主要转录因子。

因此研究团队进一步探讨了HNF4A在胰岛β细胞基因调控和T2D遗传学中的作用。首先，与WT相比，HNF4A基因敲除导致下调基因在葡萄糖代谢和青年发病型糖尿病相关基因中富集。HNF4A基因敲除系中39013个DARs中有58%被抑制，42%被激活，并表现出最大比例在DARs周围的DEGs。这些结果可能表明，HNF4A基因敲除系的DARs发生在驱动可观察到的基因表达变化调控元件中。HNF4A基因敲除系中被抑制的DARs在胰岛增强子和活跃启动子中有显著富集，而激活的DARs则没有这种富集。通过扫描HNF4A基因敲除系的DARs，发现被抑制的DARs在HNF4A结合位点上富集，而激活的DARs则在FOXA1结合位点上富集。进一步研究表明，诸多被抑制的DARs直接反映了HNF4A的结合变化，而激活的DARs是HNF4A基因敲除后的间接效应。

随后，研究人员发现HNF4A的预测结合位点可能被T2D遗传关联中的候选致病变异所干扰。HNF4A KO与WT细胞系对比中，22710个被抑制的DARs中有64个与90个可信的单核苷酸多态性（SNPs）重叠。为了测试这些SNPs对基因表达的影响，研究人员在人胰岛β细胞系EndoC-bH1中进行了等位基因特异性的荧光素酶实验。结果显示，rs7132908的“A”等位基因导致荧光素酶活性增加，而rs3205718则没有这种效应。这些数据表明，rs7132908可能是T2D关联信号处的致病变异，并且“A”等位基因可能通过减少HNF4A的结合和增强某个增强子的作用强度，增加T2D风险。在这种情况下，HNF4A可能作为一个抑制因子发挥作用。

通过比较WT细胞系和覆盖20个基因的KO细胞系，研究人员识别了与T2D相关基因对胰岛β细胞特性、基因表达和染色质可及性的下游影响。研究人员联合模拟了基因表达和染色质可及性与每个细胞特性间的关系并确定了5个编码蛋白质的基因进行因果关系测试。使用EndoC-bH1细胞，CRISPR干扰（CRISPRi）抑制了与胰岛素含量呈正相关的基因（CP和FOSB）的表达，CRISPR激活（CRISPRa）激活了与胰岛素含量呈负相关基因（RNASE1、PCSK1N、GSTA2）的表达。这5个基因中，有4个观察到了影响，即CP的抑制及RNASE1、PCSK1N和GSTA2的激活降低了总胰岛素含量。对于FOSB的抑制，未观察到显著影响。

为了更好理解CP、RNASE1、PCSK1N和GSTA2对胰岛素总含量影响的分子机制，研究人员在EndoC-bH1-luc细胞中进行了类似的CRISPR干预实验，并测量了：①INS基因转录；②胰岛素蛋白的翻译/加工。PCR结果显示CP表达的减少和RNASE1表达的增加导致INS基因表达降低。为了评估胰岛素蛋白的翻译/加工，研究人员使用了能够释放Nano-Glo荧光素酶（Nano-luc）的EndoC-bH1-luc细胞，并将荧光强度作为跟踪前体胰岛素转基因翻译和加工变化的指标。首先，研究人员通过qRT-PCR确认了在EndoC-bH1-luc细胞中CP表达减少和RNASE1、PCSK1N 、GSTA2的表达增加。然后，Nano-luc检测显示CP的抑制对胰岛素蛋白翻译/加工的影响较小，而PCSK1N 、GSTA2和RNASE1的激活大幅减少了细胞内Nano-luc的产生。综合这些实验表明，PCSK1N和GSTA2主要通过调节胰岛素蛋白的翻译或加工影响胰岛素的生产，而CP和RNASE1对INS基因的转录及下游翻译/加工过程均有影响。

此外，从与棕榈酸诱导的β细胞凋亡率相关的35个基因中，研究人员选择了5个基因（TAGLN3、ADCYAP1、DHRS2、CP和SYNPO）来测试与棕榈酸诱导凋亡率的因果关系。确认了激活TAGLN3和DHRS2，导致切割型caspase-3阳性细胞比例增加，支持TAGLN3和DHRS2在调节β细胞存活中的作用。然而，其他3个相关基因CP、ADCYAP1和SYNPO对棕榈酸诱导的β细胞凋亡没有影响，表明它们可能只涉及天然β细胞存活反应，但并不直接调节β细胞凋亡。

综上所述，研究团队成功地建立了一个同源人类胚胎干细胞平台，系统研究与T2D相关的20个基因对人类β细胞生成、胰岛素含量、葡萄糖和钾刺激下的胰岛素分泌以及β细胞存活的影响。通过细胞和分子学数据的整合，揭示了参与胰岛素产生和细胞凋亡的新因子和信号通路。此外，研究人员结合GWAS报道的T2D相关信号数据，通过精细图谱分析和等位基因不平衡定量分析，进一步鉴定了多个T2D遗传关联信号中的关键SNP。这些研究结果为揭示T2D的遗传机制提供了重要线索，并为未来的糖尿病诊断和治疗奠定了基础。

（ID:yxckbsc2024040601）

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