Cell：复旦大学陆路/孙蕾/姜世勃团队发现防治冠状病毒的新靶点，并设计出高效双功能抗病毒药物

学术 2025-01-31 10:11 上海

编辑丨王多鱼

排版丨水成文

在包膜病毒入侵宿主细胞的过程中，一些病毒能够借助其表面蛋白介导其包膜与宿主细胞膜融合，进而将遗传物质注入细胞开启感染进程。膜融合是病毒建立感染的关键环节之一。在冠状病毒家族中，这一环节由病毒表面刺突蛋白（Spike Protein，S 蛋白）介导完成。以新冠病毒（SARS-CoV-2）为例，S1 亚基产生构象变化，进而暴露出其受体结合域（RBD），并通过该结构域结合细胞受体。S1 亚基与细胞受体的结合会触发 S1 亚基解离，当 S2 亚基中蛋白酶水解位点（S2'）被宿主蛋白酶切割后，S2 亚基中的融膜肽（FP）弹出并插入宿主细胞膜，以此启动膜融合。最终，HR1 形成三螺旋束， HR2 则折叠成螺旋状，并与 HR1 三螺旋紧密结合，形成稳定的六螺旋束，促使病毒包膜与宿主细胞膜完成融合。

近年来，众多研究团队成功揭示了 SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2 以及其他一些冠状病毒 S 蛋白的 RBD 与受体结合的复合物构象，以及 S 蛋白三聚体与受体结合的融合前构象。姜世勃、陆路等研究团队也发现了 MERS-CoV（Nature Communications，2014）、SARS-CoV-2（Cell Research，2020）等 S 蛋白 HR1/HR2 形成六螺旋的融合后构象。

不过，目前仍有一个关键问题尚未明确——刺突蛋白从融合前状态转变为融合后状态时，究竟经历了怎样的构象变化。虽然已有研究者发现新冠病毒 S2 亚基中间态构象，但是对于早期的融合中间态，特别是介于受体结合和 S1 亚基脱落之间的 S 蛋白构象是否存在，及其变构细节等还一直处于认知盲区。

因此，在膜融合起始阶段，出现了一系列亟待解答的重要科学问题。比如，融膜肽如何跨越病毒包膜和细胞膜之间的“长途”距离，有效插入细胞膜；为何 S2' 位点切割对于新冠病毒诱导的膜融合起着至关重要的作用；短暂暴露的 S 蛋白融合中间态构象是否存在新的广谱抗病毒药物靶点以及能否针对该类靶点设计新型药物。这些问题成为了该领域一直以来重点关注的焦点。

2025 年 1 月 30 日，复旦大学上海医学院陆路研究员、孙蕾研究员、姜世勃教授团队合作，在国际顶尖学术期刊 Cell 上发表了题为：Early fusion intermediate of ACE2-using coronavirus spike acting as antiviral target 的研究论文。

该研究发现了 ACE2 受体诱导的冠状病毒刺突蛋白早期融合中间态构象（E-FIC），并针对该中间态构象设计了高效、广谱、兼具失活病毒和抑制病毒感染的双功能抗冠状病毒候选药物。

传统观点通常认为，冠状病毒 S1 亚基在结合受体并脱落后，会触发 S2 亚基构象重排，进而暴露HR1结构域。因此，该研究对新冠病毒S蛋白是否存在介于 ACE2 受体结合和 S1 亚基脱落之间的特殊构象进行了探索。

研究团队首先利用利用流式细胞术，发现跨膜表达的 S 蛋白在受到 ACE2 蛋白胞外域的刺激后，能够结合 HR1 抗体或其配体多肽 EK1，而此时 S1 亚基还没有脱落，提示可能存在一种不同于传统观点的早期融合中间态构象。

为了捕获并直观地呈现 S 蛋白的这种中间态构象，研究团队对 S 蛋白与 ACE2 胞外域共孵育产物进行冷冻电镜颗粒筛选。通过长时间的摸索，研究团队成功发现并解析了一种高分辨率（3.45 Å）的早期融合中间态构象（E-FIC）。在 E-FIC 中，S2 亚基发生了构象转变，其中 HR1 三螺旋结构弹出，而 S1 亚基组成环状结构结合在 S2 亚基的底部。通过进一步的结构优化和分析，研究团队发现在 E-FIC S2 亚基的 HR1 上结合着一段氨基酸序列（团队将其命名为中间态环——IL770）。值得注意的是，S2' 位点就位于 IL770 中，且突出于结合表面形成隆起，这种结构特征有利于蛋白酶的切割。

此外，通过上述构象可以推测蛋白酶对 S2' 位点的切割可能触发 IL770 从 HR1 表面剥脱，从而释放空间以利于 HR2 结合。通过对融合前和 E-FIC 结构的对比分析，研究团队发现 S 蛋白结合 ACE2 受体后，S1 亚基和 S2 亚基底部均会向细胞膜方向旋转以实现病毒膜和细胞膜初步拉近，这将有助于缩短融膜肽插入细胞膜所需的距离（图1）。

图1. SARS-CoV-2 S蛋白在诱导膜融合过程中经历的构象变化

通过对 E-FIC 结构的分析，研究团队发现，S1 亚基中的 RBD 与 S2 亚基中的 HR1 之间的空间距离被拉近，这一发现为靶向该中间体的药物设计提供了新思路（图2）。基于此构象，研究团队选用了经临床试验证明具有较好活性和安全性的 RBD 结合药物候选（ACE2蛋白）和 HR1 的结合药物候选（EK1多肽），设计出双功能域串联药物候选。

首先，由于 E-FIC 结构中 HR1 表面被 IL770 所结合，研究者通过竞争性结合实验发现，EK1 多肽能够凭借强大的相互作用从 IL770 中夺取 HR1 进行结合。随后，为了验证双功能域之间最佳连接子长度，研究团队通过表达含有 2、5、6、7 组连接子的蛋白进行活性筛选，发现由 5 组连接子串联的蛋白（AL5E）具有最佳靶点结合活性和广谱性。

后续研究结果表明，上述设计的蛋白类抗病毒活性分子具有双功能：

1）失活病毒功能：AL5E 蛋白上的 ACE2 功能域诱导游离病毒表面的 S 蛋白形成融合中间态，该中间态暴露出靠近 ACE2 的 HR1 区，随后 AL5E 蛋白中的 EK1 功能域与 HR1 三聚体结合，造成病毒 S 蛋白锁定在融合中间态，使该病毒粒子丧失感染活性；

2）抑制病毒功能：AL5E 蛋白上的 ACE2 功能域和 EK1 功能域也可分别作为抑制剂，抑制病毒对靶细胞的感染。AL5E 对新冠病毒及其变异株的抑制活性比 ACE2 蛋白提高 26 至 623 倍，对游离病毒的失活活性提高 21 至 754 倍。此外，AL5E 对其他使用 ACE2 受体的冠状病毒均具有很好的抗病毒效果。

图2. E-FIC中RBD与HR1之间的空间距离拉近

同时，为了进一步探究所设计的双功能分子在体内的活性。研究团队借助新冠病毒变异株 BA.5.2 和人冠状病毒 NL63 感染小鼠的模型，分别对 AL5E 蛋白在病毒感染治疗和病毒失活方面的效果展开了评估。结果显示，AL5E 能够显著降低小鼠肺脏中病毒载量。

这些研究不仅揭示了冠状病毒 S 蛋白在膜融合早期阶段经历的构象变化细节，还发现了其中的一些潜在药物靶点，为深入探索冠状病毒的膜融合机制及开发新型靶向性广谱药物或疫苗提供了新的思路。

复旦大学上海医学院陆路研究员、孙蕾研究员和姜世勃教授为论文共同通讯作者；复旦大学邢立晓博士后、刘治民博士、王欣玲青年研究员和刘倩莹博士为论文共同第一作者。

论文链接：

https://www.cell.com/cell/abstract/S0092-8674(25)00041-8

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