做肿瘤就逃不开预后和免疫微环境这两大热门问题，如何快速高效地发表相关文章难道不少小伙伴。当大多数目光聚焦于肿瘤细胞时，不妨看一看其他的细胞类型，也许会有意外惊喜哦。今天这篇文章，作者在自己先前一项研究的基础上，发现了PODXL主要在CC的肿瘤内皮细胞（TECs）中表达的独特作用，这不同于它在其他癌症中的作用，并提示它可以作为接受放疗或化放疗的CC患者的一个有价值的治疗靶点和生物标志物。
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一、研究背景
宫颈癌（CC）是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一 ，对于局部晚期的CC，化放疗是标准的治疗方法。然而，约有23%的患者在化放疗后出现局部或转移性复发，其总体预后仍然不佳。因此，为接受放疗或化放疗的CC患者确定可提供预后指标的新型生物标志物至关重要，这些生物标志物有可能成为优化联合疗法的靶标。据报道，足萼蛋白样（PODXL）蛋白在肿瘤细胞中过度表达，并在多种癌症的肿瘤进展和转移过程中发挥重要作用。然而，PODXL在CC中的作用，包括其表达的特定细胞类型、是否与放疗或化放疗后的预后相关，以及它如何促进CC的进展等，在很大程度上仍是未知数。
作者先前的研究对从正常宫颈到晚期宫颈鳞状细胞癌的组织进行了单细胞 RNA 测序（scRNA-seq），发现了一个 PODXL 表达升高的内皮细胞亚群，这些细胞显示出增殖特征并降低了存活率。然而，目前仍不清楚它是否像在其他肿瘤中观察到的那样，特异性地表达于接受化放疗的 CC 的 TECs 中，而不是癌细胞上，也不清楚它是如何导致肿瘤进展的。
本研究中，作者使用了一组 180 例免疫染色数据、29453 个细胞的scRNA-seq数据以及 187 例接受放疗或化疗的宫颈癌样本的大量 RNA 测序数据，对这些问题进行了研究。scRNA-seq分析显示，PODXL主要在CC的TECs中表达，肿瘤切片染色证实了这一点。在接受放疗或化疗的CC患者中，PODXL表达水平与无进展生存期和总生存期呈负相关。与低PODXL的 TECs 相比，高PODXL的 TECs 表现出抗肿瘤免疫反应减弱和肿瘤促进特征增强的特点。在接受放疗或化放疗治疗的CC的大量RNA测序数据中还发现，PODXL过度表达与免疫反应呈负相关，且生存率较低。这些结果强调了PODXL在CC中的作用，表明它是放疗或化放疗患者的一个有希望的靶点和预后标志物。
二、主要结果
1. PODXL在TECs中的主要表达及其预后价值
研究分析了5 名未经治疗的 CC 患者的 29453 个细胞的 scRNA-seq 数据（图 1A），通过已知的品系标记确定了 10 个主要细胞群，包括 NK 细胞（KLRB1）、T 细胞（PTPRC、CD3E）、B 细胞（MS4A1）、髓样细胞（CD68）、浆细胞（MZB1）、pDC（IRF7）、CAF（PDGFRB）、FAP+CAF（FAP）、上皮细胞（KRT19）和 TECs（VWF）。发现 PODXL 主要在 TECs 中表达（图 1B），且免疫荧光染色结果验证了这一结果（图 1C）。因此，PODXL是CC中TECs的特异性标记物。
图1 PODXL在TECs中的表达及其在接受放疗或化疗的CC患者中的预后价值
研究进一步探讨了接受放疗或化放疗的CC患者的PODXL表达水平与生存结果之间的关系，PODXL在CC患者中不同表达水平如图1D所示。该队列的Kaplan-Meier生存曲线显示，PODXL阳性与接受放疗或化放疗的CC患者的总生存期（OS）和无进展生存期（PFS）显著相关（图1E）。单变量 Cox 比例风险模型分析显示，PODXL 阳性、年龄、肿瘤病理类型、肿瘤细胞分化、根据 2018 年 FIGO 分期系统进行的肿瘤分期以及治疗方案是接受放疗或化放疗的 CC 患者 OS 和 PFS 的风险因素（图 1F）。随后将这些具有统计学意义的变量纳入多变量Cox比例风险模型分析，结果发现PODXL阳性、肿瘤细胞分化程度和治疗策略是接受放疗或化放疗的CC患者PFS的重要预测因素。
2. PODXL表达在接受放疗或化疗的CC患者中的作用与机制
为了研究PODXL如何促进CC的进展，分析了scRNA-seq数据中的TECs，并根据PODXL的表达水平将其分为两组（高PODXL TECs组和低PODXL TECs组）（图2A）。高PODXL TECs组高表达 SLC9A3R2、FLT1 和 TIMP3 基因，而低PODXL TECs组上调ACKR1、MMRN1 和 SELP基因（图 2B）。与 低PODXL TECs组相比，高PODXL TECs组表现出更高的肿瘤促进特性和更差的抗肿瘤免疫反应，表现为血管生成、内皮细胞生成和迁移、上皮细胞分化和迁移通路的上调，以及免疫相关特性的下调，包括抗原呈递和处理、干扰素产生、T 细胞活化和 B 细胞介导的免疫通路（图 2C-D）。内皮细胞的轨迹分析进一步显示了从高PODXL TECs 向低 PODXL TECs 的分化，同时伴随着血管生成相关基因的下调。此外，细胞相互作用分析表明，上皮细胞与高PODXL TECs 的相互作用多于与低PODXL TECs 的相互作用，特别是通过 VEGF 信号通路，促进了内皮发育和血管生成。
图2 接受放疗或化疗的CC患者中PODXL高表达的特征
为了进一步验证PODXL在接受放疗或化疗的CC患者中的作用，采用了来自TCGA数据库的大量RNA-seq数据。生存分析表明，PODXL高表达的接受放疗或化疗的CC患者预后较差（图2E）。高PODXL组和低PODXL组差异表达基因（DEGs）分析，发现高PODXL组有1536个DEGs上调，338个DEGs下调（图2F）。对上调 DEGs 进行GO分析，发现高PODXL组富集了促进上皮细胞增殖的通路（图 2G）。同时，基因组富集分析验证了高PODXL组显著富集了上皮生成调控和其他促进肿瘤进展的通路（图 2H）。此外，与上皮增殖、迁移和侵袭途径相关的基因在高PODXL组的表达水平高于低PODXL组，PODXL高表达组的病理分化程度较低。Ki67 免疫组化染色显示，PODXL高表达组中 Ki67 阳性表达的细胞比例明显更高，这进一步表明了PODXL在促进肿瘤增殖中的作用。同样重要的是，在未来的研究中，还需要进一步的功能实验来验证高PODXL TECs 亚群的肿瘤促进特性。
最后，评估了两组之间的免疫浸润情况，结果显示，低PODXL组的抗原呈递细胞和 T 细胞共刺激密度得分更高（图 2I）。总之，研究结果表明，PODXL的过度表达与免疫反应呈负相关，接受放疗或化放疗的CC患者生存率较低。
三、总结
总之，PODXL在TECs中的表达在接受放疗或化放疗的CC患者的预后方面起着重要作用。研究证实了与不良预后相关的PODXL在CC患者的TECs中特异性表达，并深入研究了其潜在特征，为了解其在癌症进展中的意义提供了新的视角。因此，PODXL可能成为接受放疗或化放疗的CC患者的重要预后标志物和治疗靶点。
研究在先前的基础上，主要应用scRNA-seq分析，结合免疫荧光染色、信号通路分析等方法，探讨了PODXL在CC的TECs中的表达和作用机制，为临床治疗提供新的依据，为新药研究提供基础。
研究只用2张图就发了9分的文章，可谓是“事半功倍”，研究从传统的肿瘤细胞上移开视线，发现一个和免疫微环境同样相关的细胞，为研究带来创新性。研究虽然没有进行进一步的细胞功能实验等，但是通过生信分析大致点明其中的作用机制，为后续研究提供了有利的基础。希望小伙伴们可以从文章中获取灵感，学习方法，未来应用在自己的研究中。
参考文献
Huang, R., Wang, F., Zou, W. et al. Tumor endothelium-derived PODXL correlates with immunosuppressive microenvironment and poor prognosis in cervical cancer patients receiving radiotherapy or chemoradiotherapy. Biomark Res 12, 106 (2024).
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