论著｜海藻糖凝胶对大鼠全层皮肤缺损创面及兔耳瘢痕增生的影响
文摘
科学
2024-07-22 17:37
北京
海藻糖凝胶对大鼠全层皮肤缺损创面及兔耳瘢痕增生的影响
作者单位：复旦大学高分子科学系，上海 200433；上海市医疗器械化妆品审评核查中心医疗器械审评二部，上海 201802
引用本文：金剑, 储云高. 海藻糖凝胶对大鼠全层皮肤缺损创面及兔耳瘢痕增生的影响[J]. 中华烧伤与创面修复杂志, 2024, 40(7): 679-688. DOI: 10.3760/cma.j.cn501225-20240118-00020.
摘要
目的 探讨海藻糖凝胶对大鼠全层皮肤缺损创面及兔耳瘢痕增生的影响。
方法 该研究为实验研究。制备海藻糖凝胶和卡波姆凝胶，辐照灭菌后观察其外观并检测其粘度、成模率、阻菌率、重金属含量、保湿率、水蒸气透过率、无菌性等理化特性和细胞毒性、皮内刺激、致敏性等生物相容性。取30只8~10周龄雄性SD大鼠，按照随机数字表法分为实验组、阳性对照组、阴性对照组，每组10只。在阴性对照组、阳性对照组、实验组大鼠背部制备全层皮肤缺损创面模型，分别进行常规换药、卡波姆凝胶换药、海藻糖凝胶换药处理。统计伤后6、12 d创面愈合率并记录创面愈合时间。伤后6 d，采用透射电镜观测大鼠创面组织中自噬体和自噬溶酶体数量，采用酶联免疫吸附测定法检测大鼠创面组织中微管相关蛋白轻链3Ⅰ（LC3Ⅰ）和LC3Ⅱ含量并计算其比值，采用天狼星红-苦味酸染色法检测大鼠创面组织中Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白占比及其比值和总胶原蛋白占比。前述实验样本数均为5。取3只3~4个月龄雄性新西兰白化模型兔，在每侧兔耳各制备3个深达软骨膜的创面，同前进行分组和处理，每组6个创面。创面愈合后30 d，大体观察并使用温哥华瘢痕量表评估兔耳瘢痕情况，采用苏木精-伊红染色检测兔耳瘢痕组织中表皮和真皮的厚度，采用天狼星红-苦味酸染色检测兔耳瘢痕组织中Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白占比及其比值和总胶原蛋白占比及其排布情况。样本数为6。
结果 辐照后的海藻糖凝胶和卡波姆凝胶均呈淡黄色透明状，无异味和杂质。海藻糖凝胶粘度、成膜率、阻菌率、保湿率均显著优于卡波姆凝胶（t值分别为4.13、3.50、4.03、5.80，P<0.05），但水蒸气透过率显著低于卡波姆凝胶（t=-4.14，P<0.05）。2种凝胶均未检出重金属和细菌。2种凝胶均无细胞毒性，皮内刺激和致敏性均为阴性。伤后6、12 d，阳性对照组大鼠创面愈合率均明显高于阴性对照组（t值分别为-6.82和-4.58，P<0.05），实验组大鼠创面愈合率均明显高于阳性对照组（t值分别为-8.90和-4.25，P<0.05）和阴性对照组（t值分别为-8.78和-4.25，P<0.05）。阳性对照组和实验组大鼠创面愈合时间分别为（20.4±2.5）、（23.4±2.5）d，均明显短于阴性对照组的（27.0±2.1）d（t值分别为2.45、-4.49，P<0.05）。伤后6 d，实验组大鼠创面组织中自噬体和自噬溶酶体数量均显著多于阳性对照组（t值分别为7.37和9.33，P<0.05）和阴性对照组（t值分别为-7.06和-8.54，P<0.05）。伤后6 d，阳性对照组大鼠创面组织中LC3Ⅱ含量及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ均显著高于阴性对照组（t值分别为-4.48和-2.47，P<0.05）；实验组大鼠创面组织中LC3Ⅱ含量及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ均显著高于阴性对照组（t值分别为11.98和6.04，P<0.05）和阳性对照组（t值分别为-6.64和-4.17，P<0.05），LC3Ⅰ含量明显低于阴性对照组（t=2.33，P<0.05）。伤后6 d，3组大鼠创面组织中总胶原蛋白和Ⅰ型胶原蛋白占比均相近，P>0.05。伤后6 d，阳性对照组大鼠创面组织中Ⅲ型胶原蛋白占比显著高于阴性对照组（t=-3.19，P<0.05），且Ⅰ型胶原蛋白/Ⅲ型胶原蛋白显著低于阴性对照组（t=2.18，P<0.05）；实验组大鼠创面组织中Ⅲ型胶原蛋白占比显著高于阴性对照组和阳性对照组（t值分别为-2.38和5.91，P<0.05），且Ⅰ型胶原蛋白/Ⅲ型胶原蛋白显著低于阴性对照组和阳性对照组（t值分别为3.08和-4.35，P<0.05）。创面愈合后30 d，可观察到阳性对照组兔耳瘢痕增生情况与阴性对照组相近，而实验组兔耳瘢痕增生情况明显减轻。创面愈合后30 d，实验组兔耳瘢痕色泽、血管、厚度、硬度评分及总分均明显低于阳性对照组（t值分别为3.80、3.80、2.39、2.71、4.84，P<0.05）和阴性对照组（t值分别为-3.81、-4.78、0.04、-2.71、-5.14，P<0.05）。创面愈合后30 d，实验组、阴性对照组和阳性对照组兔耳瘢痕组织中表皮厚度相近（P>0.05）；阳性对照组兔耳瘢痕组织真皮厚度明显小于阴性对照组（t=5.42，P<0.05），实验组兔耳瘢痕组织真皮厚度明显小于阴性对照组和阳性对照组（t值分别为11.91和8.49，P<0.05）。创面愈合后30 d，3组兔耳瘢痕组织中胶原蛋白排列均紊乱，总胶原蛋白占比相近（P>0.05）；实验组兔耳瘢痕组织中Ⅰ型胶原蛋白占比明显低于阳性对照组（t值分别为3.00，P<0.05），Ⅲ型胶原蛋白占比明显高于阴性对照组和阳性对照组（t值分别为-4.46和4.05，P值均<0.05），Ⅰ型胶原蛋白/Ⅲ型胶原蛋白明显低于阴性对照组和阳性对照组（t值分别为8.50和-5.25，P值均<0.05）。
结论 海藻糖凝胶相较于卡波姆凝胶具有更适于创面愈合的理化特性，且生物相容性良好；能基于自噬激活作用促进大鼠全层皮肤缺损创面愈合，减轻兔耳瘢痕增生。
关键词：生物相容性材料；海藻糖；瘢痕；自噬；创面修复
创面是日常生活中常见疾病，尤其是老龄化的进展导致压疮、糖尿病足等慢性创面的发病率逐年增长［1-3］。随着生活水平的提高，人们追求的创面治疗效果已不仅仅局限于创面闭合，对于愈合质量的关注越来越多，尤其是对瘢痕的预防［4-6］。自噬是细胞自我保护的重要机制，涉及识别细胞内受损的蛋白质和/或细胞器［7-9］。适宜程度的自噬对创面愈合是有利的，能诱导创面细胞的自我修复，从而促进增殖、迁移等一系列病理生理活动，加速创面愈合［10-12］。通过增强创面细胞自噬活性来促进创面愈合的研究也成为近年来的热点。海藻糖广泛存在于藻类、节肢动物等生物体内，是应激产物，用以维持这些生物在恶劣环境中的生存［13-15］。虽然人体自身无法合成海藻糖，但海藻糖含有的蛋白质、具有细胞保护作用的物质等生物活性成份使之成为酶、疫苗等生物制品以及精子、移植器官的保护剂［10，16］。海藻糖目前也已被证实与细胞和组织损伤后修复相关，如对肝脏缺血再灌注损伤［17］、紫外线照射和辐射损伤 ［18］、低温烫伤［19］的细胞等具有修复作用。海藻糖的众多生物活性与其能增强细胞自噬作用相关，故本研究通过动物模型探索细胞自噬在海藻糖促进创面愈合中的作用。本实验研究遵循国家有关实验动物管理和使用的相关规定。30只8~10周龄、体重180~220 g 的清洁级雄性SD大鼠与8只3~4个月龄、体重2 500~3 000 g的雄性新西兰白化模型兔及5只3~4个月龄、500~600 g的清洁级雄性豚鼠均购自海军军医大学实验中心，许可证号：SCXK〔Shanghai〕2012-0003。L929细胞购自南京科佰生物科技有限公司，海藻糖粉剂购自上海迪派生物科技有限公司，卡波姆、三乙醇胺粉剂购自武汉拉那白医药化工有限公司，微管相关蛋白轻链3Ⅰ（microtubule-associated protein light chain 3 Ⅰ， LC3Ⅰ）和LC3Ⅱ的ELISA试剂盒购自艾博抗（上海）贸易有限公司，天狼星红、苦味酸购自上海麦克林生化科技股份有限公司。DV2T型粘度计购自布鲁克菲尔德资产管理公司，TH-F120型透射电镜购自国仪量子技术（合肥）股份有限公司。使用卡波姆作为凝胶基质，按照终质量分数2%海藻糖［10］、终质量分数0.5%卡波姆及适量三乙醇胺（调节凝胶pH值至7）配比制作海藻糖凝胶；同时配制不含海藻糖的卡波姆凝胶，作为后续实验的阳性对照。随后，采用15~25 kGy的辐照强度对凝胶进行灭菌。按照《中华人民共和国药典》通则等检测2种凝胶的外观、粘度、成模率、阻菌率、重金属含量、保湿率、水蒸气透过率、无菌性。所有检测重复5次。按照GB/T 16886检测2种凝胶的细胞毒性、皮内刺激、致敏性。将凝胶溶解在生理盐水中，得到终质量浓度为0.2 g/mL凝胶浸提液，进行如下检测。（1）细胞毒性，按照1∶1的体积比将浸提液与常规细胞培养基混合，作为L929细胞的培养液。培养24 h后，于光学显微镜10倍放大倍数下观察细胞增殖情况及形态，同时采用噻唑蓝法检测细胞毒性。（2）皮内刺激，将1 mL浸提液注入5只新西兰白化模型兔预先剃净背部毛发的皮下，分别在24、48 h后观察皮肤红斑和肿块情况。（3）致敏性，将1 mL浸提液涂抹在5只豚鼠预先剃净背部毛发的皮肤上，分别在24、48、72 h观察皮肤红斑和肿块情况。所有检测重复5次。取30只SD大鼠，按照随机数字表法分为实验组、阳性对照组、阴性对照组，每组10只。在大鼠背部制作直径3 cm圆形全层皮肤缺损创面模型。对阴性对照组创面行含氯己定的消毒液、生理盐水冲洗以及碘伏浸润的油纱覆盖、无菌纱布包扎；对阳性对照组创面同前冲洗后涂抹卡波姆凝胶，其余操作同阴性对照组；对实验组创面涂抹海藻糖凝胶，其余操作与阴性对照组一致。每3天换药1次。在伤后0（即刻）、6、12 d拍照并计算创面愈合率。创面愈合率（%）=（创面初始面积-创面残余面积）÷创面初始面积×100%。伤后6 d，从每组中随机选择5只大鼠行颈椎脱臼处死。取前述大鼠创面组织，于透射电镜400倍放大倍数下观测其全部视野下组织中自噬体和自噬溶酶体数量，常规采用ELISA法检测组织中LC3Ⅰ和LC3Ⅱ含量并计算其比值，采用天狼星红-苦味酸染色法检测荧光显微镜400倍放大倍数下Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白占比及其比值和总胶原蛋白占比。统计每组剩余5只未处死大鼠创面的愈合时间。样本数均为5。取3只新西兰白化模型兔，在每侧兔耳各制备3个直径1 cm的深达软骨膜的创面，分别设为实验组、阳性对照组、阴性对照组，每组6个创面。各组处理同SD大鼠创面模型。创面愈合后30 d，大体观察并使用温哥华瘢痕量表评估兔耳瘢痕情况。然后，行过量麻醉剂处死，取兔耳瘢痕组织并常规行HE染色，检测表皮和真皮的厚度；另取兔耳瘢痕组织行天狼星红-苦味酸染色，检测荧光显微镜400倍放大倍数下Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白占比及其比值和总胶原蛋白占比及其排布情况。样本数为6。使用SPSS 26.0统计软件进行数据处理。计量资料数据均符合正态分布，以![]()
表示。单一时间点多个数据或多组间总体比较，行单因素方差分析；而多个时间点多组间总体比较，行重复测量方差分析。兔耳瘢痕组织相关数据的组间两两比较使用配对样本t检验，其余指标的组间两两比较使用独立样本t检验。P<0.05为差异有统计学意义。辐照后的海藻糖凝胶和卡波姆凝胶均呈淡黄色透明状，无异味和杂质。海藻糖凝胶粘度、成膜率、阻菌性、保湿率均显著优于卡波姆凝胶（P<0.05），但水蒸气透过率显著低于卡波姆凝胶（P<0.05），见表1。2种凝胶均未检出重金属和细菌。![]()
培养24 h后，卡波姆凝胶和海藻糖凝胶浸提液中的L929细胞生长状态均良好，细胞的存活率分别为（97.8±2.7）%和（99.7±3.7）%，差异无统计学意义（t=0.90，P=0.393）。皮内刺激24、48 h后，2种凝胶的红斑和水肿评分均为0，即皮内刺激阴性。刺激24、48、72 h后，2种凝胶对皮肤均无明显致敏表现，即致敏阴性。见图1。![]()
伤后6、12 d，阳性对照组大鼠创面愈合率明显高于阴性对照组（t值分别为-6.82和-4.58，P值分别为<0.001和0.002），实验组大鼠创面愈合率明显高于阳性对照组（t值分别为-8.90和-4.25，P值分别为<0.001和0.003）和阴性对照组（t值分别为-8.78和-4.25，P值均<0.001）。阳性对照组和实验组大鼠创面愈合时间明显短于阴性对照组（t值分别为2.45、-4.49，P值分别为0.040、0.002），见图2、表2。![]()
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伤后6 d，阳性对照组大鼠创面组织中自噬体和自噬溶酶体数量与阴性对照相近（t值分别为-1.77和-0.41，P值分别为0.115和0.694）；实验组大鼠创面组织中自噬体和自噬溶酶体数量均显著多于阳性对照组（t值分别为7.37和9.33，P值均<0.001）和阴性对照组（t值分别为-7.06和-8.54，P值均<0.001）。伤后6 d，阳性对照组大鼠创面组织中LC3Ⅱ含量及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ均显著高于阴性对照组（t值分别为-4.48和-2.47，P值分别为0.002和0.039），LC3Ⅰ含量与阴性对照组相近（t=0.81，P=0.439）；实验组大鼠创面组织中LC3Ⅱ含量及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ均显著高于阴性对照组（t值分别为11.98和6.04，P值均<0.001）和阳性对照组（t值分别为-6.64和-4.17，P值分别为<0.001和0.003），LC3Ⅰ含量明显低于阴性对照组（t=2.33，P=0.048）。见图3、表3。![]()
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伤后6 d，3组大鼠创面组织中的总胶原蛋白和Ⅰ型胶原蛋白占比均相近，P>0.05。伤后6 d，阳性对照组大鼠创面组织中Ⅲ型胶原蛋白占比显著高于阴性对照组（t=-3.19，P=0.013），且Ⅰ型胶原蛋白/Ⅲ型胶原蛋白显著低于阴性对照组（t=2.18，P=0.036）；实验组大鼠创面组织中Ⅲ型胶原蛋白占比显著高于阴性对照组和阳性对照组（t值分别为-2.38、5.91，P值分别为0.045、<0.001），且Ⅰ型胶原蛋白/Ⅲ型胶原蛋白显著低于阴性对照组和阳性对照组（t值分别为3.08、-4.35，P值分别为0.015、0.002）。见图4、表4。![]()
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创面愈合后30 d，可观察到阳性对照组兔耳瘢痕增生情况与阴性对照组相近，而实验组兔耳瘢痕增生情况明显减轻、颜色更接近周围正常皮肤，未明显凸出，见图5。创面愈合后30 d，阳性对照组兔耳瘢痕色泽、血管、厚度、硬度评分及总分与阴性对照组均相近（t值分别为0.42、0.62、0.62、<0.01、0.96，P值分别为0.687、0.549、0.549、>0.999、0.360）；实验组兔耳瘢痕色泽、血管、厚度、硬度评分及总分均明显低于阳性对照组（t值分别为3.80、3.80、2.39、2.71、4.84，P值分别为0.004、0.004、0.038、0.022、<0.001）和阴性对照组（t值分别为-3.81、-4.78、0.04、-2.71、-5.14，P值分别为0.003、<0.001、0.022、0.022、<0.001），见图6。![]()
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创面愈合后30 d，实验组、阴性对照组和阳性对照组兔耳瘢痕组织中表皮厚度无明显差异（P>0.05）；阳性对照组兔耳瘢痕组织真皮厚度明显小于阴性对照组（t=5.42，P<0.001），实验组兔耳瘢痕组织真皮厚度明显小于阴性对照组和阳性对照组（t值分别为11.91和8.49，P值均<0.001）。创面愈合后30 d，3组兔耳瘢痕组织中胶原蛋白排列均紊乱，总胶原蛋白占比相近（P>0.05）；实验组兔耳瘢痕组织中Ⅰ型胶原蛋白占比明显低于阳性对照组（t=3.00，P=0.013），Ⅲ型胶原蛋白占比明显高于阴性对照组和阳性对照组（t值分别为-4.46和4.05，P值分别为0.001和0.002），Ⅰ型胶原蛋白/Ⅲ型胶原蛋白明显低于阴性对照组和阳性对照组（t值分别为8.50和-5.25，P值均<0.001）。见图7、表5。![]()
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适度的自噬是细胞自我保护的重要机制，通过降解自身损伤的蛋白或细胞器，使之成为自我修复的原料，同时诱发一系列的病理生理活动［14，20］。已有研究证实，自噬也是促进创面愈合的重要作用机制之一［10-12］。创面的形成是一种应激刺激，虽然应激也是激活细胞自噬的因素之一，但是对于创面来说，应激激活的自噬不足以弥补应激本身对创面产生的不利影响。海藻糖是众多生物的应激产物，是这些生物在面对恶劣生存环境时大量合成的产物，用以维持生存［21-23］。其中，海藻糖的自噬诱导活性在应激保护中起关键作用［10］。本研究基于海藻糖的自噬诱导活性，探索其在创面治疗中的应用效果。为使海藻糖与创面充分、持续接触，本研究将海藻糖制成具有一定流动性的凝胶态，其良好的随形性使之可以与创面基底充分接触［24-26］，且相较于海藻糖原材料的粉末状剂型，不易在创面形成药痂。所使用的凝胶基质为卡波姆，为避免凝胶本身所携带的病原微生物导致创面感染，在将其应用于创面前进行了辐照灭菌。本研究显示，海藻糖对于卡波姆的高分子结构在辐照条件下具有良好的保护作用，使辐照后的海藻糖凝胶的粘度高于卡波姆凝胶。基于粘度的差异，海藻糖凝胶具有更好的成模性、阻菌性和保湿性，这些特征都有利于创面愈合，成模性能提供良好物理屏障，阻菌性能减少外界环境中病原微生物对创面的侵袭，保湿性能提供湿性愈合环境［27-28］。虽然相较于卡波姆凝胶，海藻糖凝胶的水蒸气透过率降低，但因所形成的物理屏障强度较低，因此无湿疹产生的风险［29］。另外，所制备的海藻糖凝胶具有良好的生物相容性，满足临床应用需求。本研究显示，在动物创面模型的应用中，虽然不含海藻糖的卡波姆凝胶也能一定程度促进创面愈合，但海藻糖凝胶的促进愈合活性更佳。卡波姆凝胶的促愈合作用主要基于其理化特性，如成模性、阻菌性和保湿性［27-31］。海藻糖凝胶除了具有良好的理化特性，还具有生物活性［10］。本研究通过透射电镜观察到，相较于阴性对照组，实验组大鼠全层皮肤缺损创面组织内自噬活性增强，且无论是自噬体还是自噬溶酶体的数量均显著增多，这提示海藻糖不但激活了自噬，而且能保障自噬的顺利进展，为创面细胞的自我修复提供了良好的保障。同时，LC3Ⅰ含量下降、LC3Ⅱ含量以及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ增高，均提示自噬增强。另外，海藻糖凝胶还促进了创面愈合组织中Ⅲ型胶原蛋白的合成，并降低了Ⅰ型胶原蛋白/Ⅲ型胶原蛋白的比例。Ⅲ型胶原蛋白是皮肤软组织中的重要组分之一，在创面愈合过程中Ⅲ型胶原蛋白合成减少，导致Ⅰ型胶原蛋白/Ⅲ型胶原蛋白增加，是病理性瘢痕增生的重要因素；此外，Ⅲ型胶原蛋白占比高是母体内胎儿不会形成瘢痕增生的重要因素之一［31-33］。这一现象提示海藻糖具有潜在瘢痕预防活性。本研究中的兔耳瘢痕模型验证了这一假设。单纯的卡波姆凝胶无法改善瘢痕增生，温哥华瘢痕量表评分未显著降低。但海藻糖凝胶显著减轻了瘢痕增生，无论是色泽、血管还是厚度、硬度，总分均显著降低。组织学观察也证实了海藻糖对瘢痕的改善作用。本研究基于海藻糖制备了具有良好理化特性和生物相容性的随形性凝胶，验证了其通过自噬促进创面愈合、改善瘢痕增生的活性。但仍需开展更深入的作用机制探索，为其临床应用提供理论依据。作者贡献声明
金剑：酝酿和设计实验、实施研究、采集数据、整理数据、统计分析、撰写论文、修改论文；储云高：研究指导、数据整理、论文修改、经费支持参考文献略
引用本文: 罗高兴, 卢毅飞, 黄灿. 功能性水凝胶促进皮肤创面的修复[J]. 中华烧伤与创面修复杂志, 2023, 39(1): 9-14. DOI: 10.3760/cma.j.cn501225-20221123-00503.
引用本文: 荀浩怡, 苏小薇, 胡方超, 等. 改良型富血小板纤维蛋白/壳聚糖温敏水凝胶对糖尿病大鼠全层皮肤缺损创面愈合的影响[J]. 中华烧伤与创面修复杂志, 2024, 40(5): 451-460. DOI: 10.3760/cma.j.cn501225-20231020-00127.
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