论著｜糖尿病足患者创缘皮肤组织中成纤维细胞与角质形成细胞的相互作用及其机制
文摘
科学
2024-08-20 11:57
北京
糖尿病足患者创缘皮肤组织中成纤维细胞与角质形成细胞的相互作用及其机制
阮琼芳 章思语 席毛毛 阮晶晶 刘淑华 李炳辉 谢卫国
作者单位：武汉大学附属同仁医院暨武汉市第三医院烧伤研究所，武汉 430060；武汉大学附属同仁医院暨武汉市第三医院烧伤科，武汉 430060；华中科技大学同济医学院附属梨园医院创面修复科，武汉 430077
引用本文：阮琼芳, 章思语, 席毛毛, 等. 糖尿病足患者创缘皮肤组织中成纤维细胞与角质形成细胞的相互作用及其机制[J]. 中华烧伤与创面修复杂志, 2024, 40(8): 1-10. DOI: 10.3760/cma.j.cn501225-20240221-00067.
摘要
目的 探讨糖尿病足患者创缘皮肤组织中成纤维细胞（Fb）与角质形成细胞（KC）的相互作用及其机制。
方法 该研究为实验研究。取华中科技大学同济医学院附属梨园医院创面修复科2021年8月收治的1例糖尿病足患者（男，33岁）和该院手外科2021年9月收治的1例急性足外伤患者（男，50岁）创缘皮肤组织，行单细胞转录组测序，分析Fb亚群中趋化因子配体和KC亚群中趋化因子受体的相互作用。收集常规培养和用高浓度葡萄糖培养7 d的人包皮Fb（HFF）的上清液，分别作为正常条件培养基（CM）和高糖CM。取HaCaT细胞，分为用正常CM培养的正常CM组和用高糖CM培养的高糖CM组，进行划痕试验，并计算划痕后24、48 h细胞迁移率（样本数为3）。利用液相悬浮芯片检测2种CM中细胞因子含量（样本数为5）。取HFF，分为常规培养的正常组和用高浓度葡萄糖培养的高糖组，培养7 d，采用实时荧光定量反转录PCR法检测CXC趋化因子配体1（CXCL1）、CXCL2、CXCL8和CXCL12的mRNA表达（样本数为6）。取正常CM组和高糖CM组HaCaT细胞，采用蛋白质印迹法检测培养48 h细胞中CXC趋化因子受体4（CXCR4）的蛋白表达（样本数为3）。取HaCaT细胞，分为正常CM组、高糖CM组、正常CM+CXCL12组、高糖CM+CXCL12组，前2组细胞处理同前，后2组细胞分别采用含重组人CXCL12的正常CM和高糖CM培养，行划痕试验并计算划痕后24、48 h细胞迁移率，采用蛋白质印迹法检测培养48 h细胞中CXCR4蛋白表达（样本数均为3）。
结果 相较于急性足外伤创缘皮肤组织，糖尿病足创缘皮肤组织中的Fb亚群趋化因子配体（CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL8、CXCL12）和KC亚群趋化因子受体（CXCR2和CXCR4）间的相互作用明显减弱。划痕后24、48 h，高糖CM组HaCaT细胞迁移率均明显低于正常CM组（t值分别为23.50、15.65，P<0.05）。相较于正常CM，高糖CM中的CXCL1含量明显增多（P<0.05），CXCL12含量明显减少（P<0.05）。培养7 d，相较于正常组，高糖组HFF中CXCL1、CXCL2和CXCL8的mRNA表达均明显升高（t值分别为4.25、4.98、10.04，P<0.05），CXCL12的mRNA表达明显降低（t=4.10，P<0.05）。培养48 h，高糖CM组HaCaT细胞中的CXCR4蛋白表达明显低于正常CM组（t=5.13，P<0.05）。划痕后24、48 h，高糖CM组HaCaT细胞迁移率较正常CM组和高糖CM+CXCL12组明显降低（P值均<0.05）；划痕后24 h，正常CM+CXCL12组HaCaT细胞迁移率较正常CM组明显降低（P<0.05）；划痕后48 h，正常CM+CXCL12组HaCaT细胞迁移率较高糖CM+CXCL12组明显升高（P<0.05）。培养48 h，高糖CM+CXCL12组HaCaT细胞中CXCR4蛋白表达为0.446±0.050，明显高于高糖CM组的0.247±0.010（P<0.05），与正常CM+CXCL12组的0.522±0.082相近（P>0.05）；正常CM组HaCaT细胞中CXCR4蛋白表达为0.509±0.055，明显高于高糖CM组（P<0.05）。
结论 糖尿病足创缘皮肤组织中的Fb亚群趋化因子配体和KC亚群趋化因子受体间的相互作用明显减弱。高糖抑制HFF分泌CXCL12，其细胞培养上清液刺激导致HaCaT细胞迁移减弱、CXCR4表达降低。给予外源性CXCL12蛋白可增加HaCaT细胞中 CXCR4的蛋白表达，增强细胞迁移能力。
关键词：细胞间通讯；趋化因子，CXC；受体，趋化因子；成纤维细胞；角质形成细胞；细胞迁移；创面修复
糖尿病足是非创伤性下肢截肢的主要原因［1］。据报道，全世界每年因糖尿病足溃疡导致不同程度截肢的人群超过100万［2］。在中国，因糖尿病足进行大截肢或小截肢的患者在手术后5年的病死率接近 40%，因此糖尿病足是一个严重的公共卫生问题［3-4］。阐明糖尿病足创面愈合障碍的潜在机制具有重要意义［5］。创面愈合是一个复杂的生物学过程［6-7］。皮肤损伤后，创面愈合过程启动，通过募集免疫细胞、Fb、KC及间充质细胞，共同调控创面愈合过程［8-9］。创面微环境由不同类型的细胞组成，各种类型细胞为了在创面愈合过程中表现出适当的作用，必须进行细胞间通讯［10-12］。本课题组前期单细胞转录组测序结果显示，糖尿病足创缘皮肤组织中的Fb与KC间通讯明显减弱，但其具体机制尚未被阐明。因此，本研究进一步对上述2种细胞间的相互作用进行分析，观察高糖微环境下人包皮Fb（human foreskin fibroblast，HFF）培养上清液作为条件培养基（conditioned medium，CM）对HaCaT细胞迁移的影响，并初步探究可能的作用机制，以期为糖尿病足创面的临床治疗提供新的思路及理论依据。本实验研究经华中科技大学同济医学院附属梨园医院医学伦理委员会批准，批号：［2020］IEC（SQ09）。人KC细胞株HaCaT、HFF细胞株由中国科学院上海细胞库提供。DMEM培养基、DMEM/F12培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司，重组人CXC趋化因子配体12（C-X-C motif chemokine ligand 12，CXCL12）蛋白、兔抗人CXC趋化因子受体4（ C-X-C motif chemokine receptor 4，CXCR4）单克隆抗体购自英国Abcam公司，兔抗人GAPDH单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG多克隆抗体、PCR引物、实时荧光定量RT-PCR试剂盒、化学发光检测试剂盒、蛋白定量测定试剂盒购自武汉塞维尔生物科技有限公司。Multiskan FC型多功能酶标仪购自美国Thermo Fisher公司，ChemiDoc XRS型凝胶成像仪购自美国Bio-Rad公司，IX71型倒置相差显微镜购自日本Olympus公司。取华中科技大学同济医学院附属梨园医院创面修复科2021年8月收治的1例2型糖尿病患者（男，33岁）糖尿病足创缘皮肤组织和该院手外科2021年9月收治的1例足背部外伤患者（男，50岁）创缘皮肤组织，由南京新格元生物科技有限公司进行组织解离、单细胞悬液制备、文库构建、单细胞转录组测序。使用 CellphoneDB v2.1.0软件分析Fb亚群中趋化因子配体与KC亚群中趋化因子受体的相互作用。将1×106个HaCaT细胞接种至含体积分数10%胎牛血清和100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素混合液的DMEM培养基（以下称DMEM完全培养基）的培养瓶（底面积为25 cm2，下同）中，将1×106个HFF接种至含体积分数10%胎牛血清和100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素混合液的DMEM/F12培养基（以下称DMEM/F12完全培养基）的培养瓶中，于37 ℃、含体积分数15%二氧化碳的细胞培养箱中培养（培养条件下同）。将1×106个HFF接种至含30 mmol/L D-葡萄糖的DMEM/F12完全培养基的培养瓶中培养7 d［13-14］，以1 000×g离心5 min收集细胞培养上清液，作为高糖CM。将1×106个HFF接种至仅含DMEM/F12完全培养基的培养瓶中培养7 d后，以1 000×g离心5 min收集细胞培养上清液，作为正常CM。2种CM均用孔径0.2 μm的过滤器过滤后，置于-80 ℃冰箱备用。取HaCaT细胞，用DMEM完全培养基调整细胞浓度为1×105个/mL，接种于6孔板中，每孔2 mL。待细胞生长达90%以上融合时，用200 μL的移液器枪头和直尺在HaCaT单细胞层上划1条直线。将细胞分为正常CM组和高糖CM组，每组3孔，吸弃原有培养基，加入PBS冲洗2遍，每孔细胞分别加入2 mL正常CM和高糖CM。划痕后0（即刻）、24、48 h在倒置相差显微镜200倍放大倍数下观察细胞划痕愈合情况并计算划痕后24、48 h细胞迁移率。细胞迁移率=（划痕后0 h划痕面积-划痕后其他时间点划痕面积）÷划痕后0 h划痕面积×100%。本实验样本数为3。取正常CM和高糖CM，用人48因子液相悬浮芯片（美国Bio-Rad公司）和Bio-Plex 200系统（美国Luminex公司）检测细胞因子含量。读取仪器上表示2种CM中细胞因子含量的数值，以行对数据进行Zscore校正（均值为0、方差为1），使用热图展示2种CM中的细胞因子表达差异。此部分实验委托上海华盈生物医药科技有限公司完成。本实验样本数为5。将HFF接种到6孔板中，每孔1×105个细胞，分为高糖组和正常组，每组3孔，同1.4用高浓度葡萄糖和不含葡萄糖的DMEM/F12完全培养基培养7 d。按照TRIzol试剂盒说明书提取细胞总RNA，将RNA反转录为互补DNA。采用实时荧光定量RT-PCR法检测CXCL1、CXCL2、CXCL8、CXCL12的mRNA表达，引物序列及产物大小见表1。以β肌动蛋白为内参照，基于Δ循环阈值计算mRNA的相对表达量。本实验样本数为6。![]()
同1.5取HaCaT细胞并分组及处理48 h，提取细胞总蛋白，采用蛋白质印迹法检测CXCR4的蛋白表达。加入的一抗为兔抗人CXCR4单克隆抗体、兔抗人GAPDH单克隆抗体（稀释比均为1∶1 000），二抗为辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG多克隆抗体（稀释比为1∶2 000）。使用Image J 1.48V图像分析软件（美国国立卫生研究院）分析条带灰度值。以GAPDH为内参照，计算CXCR4的蛋白表达量。本实验样本数为3。1.9 CXCL12对高糖CM作用下HaCaT细胞迁移和CXCR4蛋白表达的影响检测
将HaCaT细胞接种到6孔板中，每孔1×105个细胞，分为正常CM组、正常CM+CXCL12组、高糖CM组、高糖CM+CXCL12组，每组3孔。正常CM组、高糖CM组细胞同1.5相同组别进行处理，正常CM+CXCL12组每孔细胞加入2 mL含100 ng/mL 重组人CXCL12的正常CM，高糖CM+CXCL12组每孔细胞加入2 mL含100 ng/mL 重组人CXCL12的高糖CM。同1.5检测细胞迁移情况，同1.8检测细胞中CXCR4的蛋白表达情况，2个实验样本数均为3。采用SPSS 15.0统计软件进行数据分析。计量资料数据均符合正态分布，以![]()
表示。单一时间点多组间总体比较行单因素方差分析，多个时间点多组间总体比较行重复测量方差分析，2组间比较行独立样本t检验，多组间两两比较行LSD检验。P<0.05为差异有统计学意义。2.1 Fb亚群中趋化因子配体和KC亚群中趋化因子受体的相互作用
与急性足外伤创缘皮肤组织比较，糖尿病足创缘皮肤组织中的Fb亚群趋化因子配体（CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL8）和KC亚群趋化因子受体CXCR2间、Fb亚群趋化因子配体CXCL12和KC亚群趋化因子受体CXCR4间的相互作用明显减弱。见图1。![]()
划痕后24、48 h，高糖CM组HaCaT细胞迁移率均明显低于正常CM组（P<0.05）。见图2和表2。![]()
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正常CM和高糖CM中共检出28个细胞因子。与正常CM比较，高糖CM中的CXCL1含量明显增多（P=0.015），CXCL2含量增多（P=0.510）；CXCL8含量减少（P=0.597），CXCL12含量明显减少（P<0.001）；正常CM和高糖CM中均未检出CXCL3。见图3。![]()
培养7 d，高糖组HFF中CXCL1、CXCL2和CXCL8的mRNA表达分别为1.54±0.16、1.51±0.16、1.70±0.08，均明显高于正常组的0.94±0.19、1.04±0.05、1.00±0.09（t值分别为4.25、4.98、10.04，P值分别为0.009、0.013、0.001）；高糖组HFF中CXCL12的mRNA表达为0.80±0.06，明显低于正常组的1.07±0.10（t=4.10，P=0.015）。培养48 h，正常CM组HaCaT细胞CXCR4的蛋白表达为0.481±0.059，明显高于高糖CM组的0.267±0.006（t=5.13，P=0.007）。见图4。![]()
2.6 CXCL12对高糖CM作用下HaCaT细胞迁移的影响
划痕后24、48 h，高糖CM组HaCaT细胞迁移率较正常CM组和高糖CM+CXCL12组明显降低（P值均<0.05）。划痕后24 h，正常CM+CXCL12组HaCaT细胞迁移率较正常CM组明显降低（P<0.05）；划痕后48 h，正常CM+CXCL12组HaCaT细胞迁移率较高糖CM+CXCL12组明显升高（P<0.05）。见图5和表3。![]()
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2.7 CXCL12对高糖CM作用下HaCaT细胞中CXCR4蛋白表达的影响
培养48 h，正常CM组、正常CM+CXCL12组、高糖CM组和高糖CM+CXCL12组HaCaT细胞中CXCR4蛋白表达分别为0.509±0.055、0.522±0.082、0.247±0.010和0.446±0.050，组间总体比较，差异有统计学意义（F=15.82，P=0.001）。与正常CM组比较，高糖CM组HaCaT细胞中CXCR4蛋白表达明显减少（P<0.001），正常CM+CXCL12组HaCaT细胞中CXCR4蛋白表达无明显变化（P=0.784）；与高糖CM组比较，高糖CM+CXCL12组HaCaT细胞中CXCR4蛋白表达明显增加（P=0.002）；正常CM+CXCL12组与高糖CM+CXCL12组HaCaT细胞中CXCR4蛋白表达相近（P=0.133）。见图6。![]()
Fb能够通过自分泌或旁分泌方式释放信号分子（细胞因子和生长因子等）感知和应答组织损伤［15-16］，与创面愈合中的KC、血管内皮细胞、巨噬细胞之间形成连接网［17-19］，在创面愈合的4个阶段（炎症反应期、肉芽组织形成期、再上皮化期和重塑期）中发挥重要调控作用［20-21］。深入阐明细胞间通讯机制对创面修复策略研究具有重要的理论指导意义。再上皮化是创面愈合过程中的重要环节［22-23］，受KC迁移和增殖的调控。相关研究主要探讨了糖尿病高糖微环境下KC功能障碍的作用机制［24］，而对KC与其他细胞间的相互调控机制探索较少。随着测序技术不断发展，单细胞转录组测序不仅能鉴定出组织细胞异质性、推测细胞分化轨迹，还能进一步分析细胞与细胞间的相互作用［25-28］。本研究对细胞中的趋化因子受体和趋化因子配体间的相互作用进行了进一步分析，结果显示与急性足外伤患者创缘皮肤组织比较，糖尿病足患者创缘皮肤组织中Fb亚群中的趋化因子配体（CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL8和CXCL12）和KC亚群中的趋化因子受体（CXCR2和CXCR4）的相互作用明显减弱。研究表明，CXCR2拮抗剂可以通过减轻炎症反应，促进再上皮化，有效促进糖尿病小鼠创面愈合［29］。CXCR4激动剂UCUF-728可以加速糖尿病小鼠创面愈合，使创面愈合时间较未采用CXCR4激动剂治疗的糖尿病小鼠缩短了36%［30］。这提示，CXCR2与CXCR4在创面愈合中发挥重要调节作用［31-32］，靶向抑制CXCR2或激活CXCR4可有效加速糖尿病创面愈合。因此，揭示CXC类趋化因子及其受体在糖尿病创面愈合中的作用机制具有重要的科学意义，可为探究新的糖尿病创面的治疗靶点提供方向。本研究用高浓度葡萄糖培养HFF，收集细胞培养上清液作为高糖CM；同时常规培养HFF，收集细胞培养上清液作为正常CM。用2种CM处理HaCaT细胞，结果显示高糖CM组HaCaT细胞迁移能力较正常CM组减弱。CM中某种趋化因子含量的多少与细胞分泌此趋化因子的能力相关。为进一步明确何种趋化因子抑制KC迁移，本研究团队利用液相悬浮芯片检测HFF的CM中趋化因子含量，利用实时荧光定量RT-PCR技术检测HFF中趋化因子配体的mRNA表达水平。结果显示，与正常CM比较，高糖CM中的CXCL1和CXCL2含量增多，CXCL8和CXCL12含量减少，2种CM中均未检出CXCL3；与正常组比较，高糖组HFF中CXCL12的 mRNA表达显著下调，CXCL1、CXCL2和CXCL8的mRNA表达显著上调。据报道，糖尿病小鼠创面组织中CXCL12的mRNA表达较非糖尿病小鼠创面下调［33］，与本研究实验结果一致。本研究团队推测，高糖组HFF中CXCL12表达与分泌减少，可能是导致HaCaT细胞迁移障碍的重要原因。本研究利用蛋白质印迹法检测HaCaT细胞中CXCR4（CXCL12受体）蛋白表达，结果显示高糖CM组HaCaT细胞中CXCR4表达较正常CM组下降，与高糖组HFF中的CXCL12变化趋势一致。这提示，HFF分泌CXCL12能力下降可能是导致HaCaT细胞中CXCR4表达下调的原因。本研究针对高糖CM中CXCL12含量减少的情况，利用重组人CXCL12蛋白干预不同CM处理的HaCaT细胞，划痕试验结果显示，高糖CM+CXCL12组细胞迁移率较高糖CM组显著升高；蛋白质印迹法检测结果显示，高糖CM+CXCL12组细胞CXCR4蛋白表达量也较高糖CM组显著升高，提示CXCL12蛋白可能通过上调CXCR4来改善高糖CM处理的HaCaT细胞的迁移能力。文献报道，利用CXCL12拮抗剂可以明显延长糖尿病小鼠创面愈合时间，过表达CXCL12则可将创面愈合时间从55 d（未干预的糖尿病小鼠创面愈合时间）缩短至23 d［33-35］，这一研究结果与本研究中外源性重组人CXCL12蛋白加速高糖CM处理的HaCaT细胞迁移的实验结果一致。综上，本研究证实高糖抑制HFF分泌CXCL12，高糖CM导致HaCaT细胞迁移减弱、细胞中CXCR4表达降低，外源性重组人CXCL12可通过上调CXCR4表达，增强HaCaT细胞的迁移能力，这在一定程度上揭示了CXCL12在糖尿病创面愈合中的作用，为其作为难愈性创面治疗靶点提供了理论依据。后续本研究团队将进一步明确CXCL1-CXCR2调控糖尿病创面愈合的机制，及CXCL1与CXCR2、CXCL12与CXCR4间的相互作用，以期为探究多种趋化因子联合治疗难愈性创面的临床方案提供更为可靠的依据。作者贡献声明
阮琼芳：实验设计与实施、文章起草、获取研究经费；章思语：实验实施；席毛毛：数据整理与统计分析；阮晶晶：数据收集与材料支持；李炳辉：临床病例资料收集；刘淑华、谢卫国：对文章的知识性内容做批评性审阅参考文献略
引用本文: 欧泽林, 王珏, 时荣, 等. 负载焦亡抑制剂的活性氧响应性自组装纳米胶束对糖尿病大鼠全层皮肤缺损的影响[J]. 中华烧伤与创面修复杂志, 2023, 39(1): 35-44. DOI: 10.3760/cma.j.cn501225-20221109-00483.
引用本文: 荀浩怡, 苏小薇, 胡方超, 等. 改良型富血小板纤维蛋白/壳聚糖温敏水凝胶对糖尿病大鼠全层皮肤缺损创面愈合的影响[J]. 中华烧伤与创面修复杂志, 2024, 40(5): 451-460. DOI: 10.3760/cma.j.cn501225-20231020-00127.
引用本文: 曹涛,肖丹,计鹏,等.肝细胞生长因子修饰的人脂肪间充质干细胞外泌体对糖尿病小鼠全层皮肤缺损的作用[J].中华烧伤与创面修复杂志,2022,38(11):1004-1013.DOI:10.3760/cma.j.cn501225-20220731-00330.
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