iMetaOmics | 白立景/邢凯组-解析脊椎动物肠道微生物多样性的影响因素

全球荟萃分析揭示了脊椎动物肠道微生物变异的驱动因素

●  宿主饮食和栖息地气候因素显著影响肠道微生物的组成和功能；

●  脊椎动物肠道微生物多样性随着栖息地纬度的降低而增加；

●  肠道微生物中拟杆菌门和变形菌门的丰度受气候因素显著影响；

●  脊椎动物和同域土壤之间存在潜在抗性基因的水平转移。

引  言

适应性是生物体最显著的特征之一，也是其在多样化环境中生存的关键能力。除了宿主固有的变异和突变外，居住在动物肠道中的数万亿微生物也可能为宿主提供适应性优势。肠道微生物能够促进宿主饮食生态位的多样化，从而改变未来的宿主适应轨迹。例如，专门食用桉树叶的考拉，其肠道微生物中与植物次生代谢物消化相关的细菌功能通路，比其近缘物种袋熊更为丰富。

肠道微生物的变化还可能影响宿主的生理和代谢功能，如体重指数、内脏脂肪和代谢综合征等。在牛中，肠道微生物与饲料效率、甲烷排放、瘤胃和血液代谢物及乳制品生产效率密切相关。已有研究假设，选择压力可能重塑肠道微生物，以增强宿主的适应能力。例如，缺乏Toll样受体的小鼠肠道微生物失调，严重影响宿主的代谢及获取能量的能力。然而，由于大多数研究都局限于单一物种、样本量较小或地理分布有限，目前关于脊椎动物肠道微生物对适应性进化的贡献还未完全理解。

肠道微生物的组成受多种内在和外在因素的影响，其中宿主的饮食习性、系统发育、社会互动及环境因素（如气候和土壤）尤为关键。气候变化不仅影响宿主的生理和免疫功能，还会影响宿主从周围环境中选择微生物的能力。近年来，许多研究集中在宿主的饮食和系统发育上，这些已知因素会导致动物肠道微生物的变化，而环境因素及其对不同气候条件的响应研究较少。虽然有几篇报告探讨了气候变化对肠道微生物群落的影响，但很少有研究涉及气候因素与脊椎动物肠道微生物在全球范围内的关系。土壤作为宿主可能接触的重要外部因素，也为微生物提供了多样性来源。同时，抗生素暴露和胃肠道功能障碍等因素也会导致脊椎动物肠道微生物的变化。研究表明，携带抗性基因的可移动遗传元件（如质粒、转座子等）可以在土壤微生物和脊椎动物肠道微生物之间转移，尤其是在宿主频繁接触土壤的情况下，这可能加剧全球抗生素抗性的问题。例如，Chen等人使用了土壤跳虫（Folsomia candida）-捕食螨（Hypoaspis aculeifer）作为模型食物链，观察到粪肥的施用显著增加了跳虫和捕食螨微生物群中的抗性基因，导致抗性基因的转移，改变了微生物群落结构，并降低了微生物多样性。通过结合气候和土壤这两个外部因素，我们不仅可以更好地理解它们对肠道微生物的影响，还能揭示这些因素通过影响微生物群落组成和功能，进一步影响宿主健康和适应能力的机制。

本研究收集了来自七类脊椎动物（哺乳类、鸟类、爬行类、两栖类、辐鳍鱼类、软骨鱼类和圆口纲）的6508个16S rRNA基因测序样本，同时又收集了487个陆地脊椎动物肠道微生物数据和203个同域土壤生物环境样本的宏基因组数据。本研究的目的是：（1）评估环境因素对脊椎动物肠道微生物多样性的影响；（2）根据宿主的饮食和栖息地气候因素，描述脊椎动物肠道微生物的组成和功能；（3）鉴定脊椎动物肠道微生物与同域土壤样本之间潜在的基因水平转移现象。

结  果

为了全面描述脊椎动物的肠道微生物，本研究分析了113种脊椎动物的肠道微生物群落的多样性和组成，包括哺乳动物（n = 4,668，60种）、鸟类（n = 792，25种）、爬行动物（n = 347，10种）、两栖动物（n = 104，5种）、辐鳍鱼（n = 520，9种）、软骨鱼（n = 33，2种）和圆口类（n = 44，3种）（图S1）。这些样本来自七大洲，包括了不同的饮食习惯、栖息地类型、圈养状态、气候区及受威胁程度（表S1）。结果表明：47 个门1,290 个属中共获得 39,613 个OTU。在门水平上比较了不同脊椎动物类群中的相对丰度，结果显示变形菌门在水生和两栖类物种的肠道微生物群中占主导地位（图1A，S2）。此外，研究还发现食草性动物（如马、考拉、鼠兔和马鹿）的肠道中富含变形菌门（图1B，S2）。

不同动物类群的肠道微生物可能受环境因素（如栖息地类型、地理位置和气候）和遗传因素的影响。这些因素对脊椎动物肠道微生物多样性和组成的贡献程度尚未完全理解。研究中首先使用Shannon指数计算了肠道微生物群落的Alpha多样性（即微生物多样性的衡量标准）。哺乳动物的肠道微生物显示出最高的Alpha多样性水平（Shannon指数为5.26），而鸟类的肠道微生物得分最低（Shannon指数为3.14）（图1C）。此外，食草性动物的肠道微生物多样性最高，而食肉性动物的最低（图1D）。另外，野生脊椎动物的多样性高于圈养个体，陆生脊椎动物的微生物多样性高于水生和两栖类物种（图S3A）。本研究还观察到受威胁物种（如大熊猫）的Alpha多样性水平低于非受威胁物种（如鼠兔）（图S3A）。最后，我们比较了不同体型和肠道长度物种的多样性，结果显示体型较大且肠道较长的物种拥有更高的微生物多样性（图S3A，表S2）。

随后，我们进行了矩阵多元回归分析（MRMs），以评估各种因素对脊椎动物肠道微生物的影响。四个MRM模型（每个多样性指标一个）均具有显著的整体拟合效果。宿主的饮食和栖息地气候是主要的显著解释变量（BH校正p < 0.05，图1E，1F，S3B）。宿主饮食解释了大量的Alpha和Beta多样性变化（约8-24%），并对所有测试的多样性指标（Shannon指数、Bray-Curtis、观测特征和Jaccard距离）均有显著影响。栖息地气候也解释了大量Alpha和Beta多样性变化（约11-16%）。此外，我们使用随机森林分析确定了不同因素的相对重要性（图S4）。宿主饮食和栖息地气候是脊椎动物肠道微生物Alpha多样性最重要的因素，而宿主地理位置对Beta多样性影响最大。结果进一步证明脊椎动物肠道微生物的变化主要由饮食和气候因素驱动。

为了展示宿主饮食和栖息地气候对微生物多样性的显著影响，我们首先检查了相同纲或目内不同饮食习性脊椎动物的肠道微生物多样性，结果与图1D一致（图S5A）。随后，我们注意到最高的微生物多样性出现在中纬度地区（图1G，R² = 0.03，p < 2e-16），这与地球上另外两大主要生态系统，即海洋和空气的情况一致。同时，研究发现随着样本采集年份的增加，微生物Shannon指数逐年增加（图S5B，表S3），而全球地表温度也逐年上升。因此，温度也是一个驱动脊椎动物肠道微生物多样性的重要因素。

(A和B) 堆叠条形图展示了门分类水平的微生物分布，显示了每个分组中排名前10的类别，剩余的类别用灰色表示。按宿主脊椎动物类群（A）和饮食类型（B）分组。(C和D) 按宿主脊椎动物类群（C）和饮食类型（D）分组的肠道群落Alpha多样性水平。使用了错误发现率（FDR）校正的Wilcoxon秩和检验来确定显著性。***：p < 0.001，**：p < 0.01，*：p < 0.05。(E和F) 图显示了多元回归矩阵（MRMs）测试中BH校正p值（Adj. p value）和偏回归系数（Coef.），用于评估宿主饮食、圈养状态、地理位置、栖息地类型、系统发育、气候和威胁状态在解释Bray-Curtis指数（E）和Jaccard距离（F）方差方面的贡献。箱线图显示了每个MRM测试中100个随机数据子集（每个子集仅包括每个物种的一个样本）所获得的回归系数和调整后的p值的分布。星号表示显著性（在 ≥ 95%的数据子集中Adj. p < 0.05）。箱体中线、边缘、须状线和点分别表示中位数、四分位数范围（IQR）、1.5 × IQR和 > 1.5 × IQR。(G) 脊椎动物肠道多样性的纬度分布。基于校正的赤池信息准则（Akaike Information Criterion，AIC），确定了数据集中最佳的多项式拟合。该曲线为基于普通最小二乘回归的二阶多项式拟合（R² = 0.03，p < 2.2e-16）。颜色梯度表示与每个样本对应的采集地点的温度。符号形状表示样本来自北半球（方形）或南半球（三角形）。

为了评估饮食模式对脊椎动物肠道微生物群组成和功能的影响，我们基于Bray-Curtis距离进行了非度量多维尺度（NMDS）分析。在NMDS分析中，食肉动物和食草动物之间的差异最为显著（图2A，表S4）。选择至少50%的个体存在且相对丰度超过0.1%的属，生成物种相对丰度的热图（图2B）。结果显示，微生物群落组成的显著变化与宿主饮食差异相关（图2C, D）。例如，Acinetobacter、Aeromonas和Pseudomonas等属在食肉动物中富集，而Streptococcus的相对丰度在食草动物中较高。食草动物和食肉动物肠道微生物群中的主要KEGG（京都基因与基因组百科全书）功能类别（三级）包括氨基酸代谢与合成、蛋白质运输和糖代谢等（图2E）。其中食肉动物肠道微生物在物质运输、环境适应和抗氧化保护（如ABC转运蛋白、双组分系统、磷酸转移酶系统（PTS）和谷胱甘肽代谢）中发挥关键作用，而食草动物肠道微生物则富集于与蛋白质合成相关的途径（如核糖体、氨酰-tRNA合成、酪氨酸和色氨酸合成）（图2E）。因此，研究结果证实了饮食是决定脊椎动物肠道微生物群组成和功能的重要因素。

图2. 饮食对脊椎动物肠道微生物群组成的影响

(A)基于Bray-Curtis距离的非度量多维尺度（NMDS）图，展示了不同饮食与脊椎动物肠道细菌群落的关联。Bray-Curtis距离计算了细菌群落组成的差异性。(B) 饮食对属级分类组成的影响：展示了相对丰度超过0.1%且在 ≥ 50%的脊椎动物肠道样本中出现的47个属。红色高亮显示的属丰度较高，蓝色高亮显示的属丰度较低。(C 和 D) LEfSe分析结果。(C) 柱状图展示了线性判别分析（LDA）得分超过默认值（4）的物种。柱状图长度表示不同饮食的影响。(D) 显示无显著差异的物种以黄色标记。与不同饮食相关的脊椎动物的颜色与系统发生进化树中的饮食状态颜色一致。(E) PICRUSt2对食肉动物和食草动物肠道微生物功能的预测。展示了两组之间的功能差异。

(A 和 B) 来自不同气候区域的脊椎动物肠道微生物群的Alpha-（A）和Beta-多样性（B）水平。(C) 堆叠柱状图显示了以门分类水平的微生物群分布，展示了每个气候区内排名前7的类群，剩余类群以灰色显示，按照宿主所在的气候区分组。(D) 不同气候区内同一纲或目的脊椎动物肠道中Proteobacteria和Bacteroidetes相对丰度的趋势。(E) 不同饮食脊椎动物在不同气候区内肠道中Proteobacteria和Bacteroidetes相对丰度的趋势。

脊椎动物肠道微生物及其同域土壤生物环境中的常见抗生素抗性组的基因迁移潜力

土壤生物样本拥有丰富的抗生素抗性细菌基因库。抗生素抗性基因（ARGs）威胁着全球脊椎动物的健康，但脊椎动物肠道与其同域土壤生物环境中常见的抗性组及ARGs的迁移潜力仍不清楚。为了全面解析常见抗性组和ARGs的潜在迁移性，我们通过宏基因组测序分析了487个脊椎动物肠道微生物样本和203个同域土壤环境样本（图S1，表S6）。结果发现80.8%的ARGs属于相对丰度前十种类型（即多重耐药性、四环素、大环内酯-林可酰胺-链阳菌素（MLS）、杆菌肽、利福霉素、氨基糖苷类、β-内酰胺类、万古霉素、多粘菌素和新生霉素），这些类型占ARGs总丰度的89.1%（图4A）。此外，43种ARGs亚型（主要包括多重耐药性MexF、四环素tet(S)、MLS lmrD、杆菌肽bacA、利福霉素RbpA、氨基糖苷类AAC(6')-Ii、β-内酰胺类TEM-116、万古霉素vanI、多粘菌素arnA和新生霉素novA抗性基因）在脊椎动物肠道微生物及其同域土壤生物环境样本中共有（图4B）。特别是，大量重叠的ARGs（6.5%）在鸟类和土壤生物环境样本中共有（图4B）。我们还观察到bacA（也称为UppP，不饱和乙基焦磷酸磷酸酶）基因，该基因赋予杆菌肽耐药性，在脊椎动物和土壤生物环境样本中均有丰富表达（图4C）。此外，为了了解ARGs带来的威胁，我们使用ARG-ranker对检测到的ARGs进行风险分类，最终鉴定出427种ARGs亚型（表S7，S8）。在鸟类肠道微生物中，检测到的ARGs中20.6%属于风险等级I-II。在哺乳动物、爬行动物和两栖动物的肠道微生物中，这一比例分别为16.8%、12.4%和11%。相比之下，在农田和森林土壤类型中，仅检测到4.3%和0.3%的I-II级别ARGs（图4D）。这一现象表明，大多数存在于土壤中的ARGs并未在与人类相关的环境中富集（第Ⅳ级），表明其临床风险较低。

ARGs与细菌群落的共现网络相关性被认为是追踪各种环境中潜在ARG宿主的有效方法。为了探索ARGs与细菌群落之间的关系，我们进行了ARGs与细菌相对丰度的相关性分析。如果ARGs丰度与微生物丰度之间存在显著相关性，则该微生物可被视为潜在的ARG宿主。如图4E和表S9所示，共现网络包含74个节点（28个ARG亚型和46个ARG携带者）和287条边。在本研究中，46种隶属于4个门的细菌被鉴定为28种ARGs（属于8种ARGs类型）的潜在宿主。在这46种细菌中，Bradyrhizobium和Solibacter是12种ARGs的潜在宿主。一些细菌物种（如Phocaeicola vulgatus和Blautia obeum）与9种ARG亚型呈正相关。在28种ARGs中，18种ARG亚型与多个潜在宿主相关，例如tetO、tetQ和tetW与34种潜在ARG宿主相关。Firmicutes是最常见的门，占所选门的58.2%，并与各种ARG亚型（特别是四环素抗性基因tet32、多重耐药性基因MexF和MLS耐药性基因lnuC）呈正相关，并与多个Firmicutes建立了密切关系。此外，发现Bacteroidetes门（如Bacteroides stercoris、Phocaeicola dorei、Phocaeicola vulgatus和Pseudomonas putida）与多种抗性基因呈负相关。

图4. 脊椎动物肠道微生物群与土壤中的抗生素抗性基因

(A) 堆叠条形图显示了每个组别中检测到的前10种抗生素抗性基因类型的相对丰度，剩余类型以灰色显示。(B) 脊椎动物肠道微生物与土壤微生物中的抗生素抗性基因（ARGs）重叠情况。(C) 热图展示了覆盖10种不同耐药类型的ARG亚型在4个脊椎动物类别和5个土壤类别中的相对丰度。图中展示了相对丰度排名前50的ARG亚型。红色代表根据左下角比例尺计算的ARG亚型的相对丰度。(D) ARGs的风险评估；图中显示了RankⅠ、RankⅡ、RankⅢ和RankⅣ的百分比（%）。MLS代表大环内酯-林可酰胺-链丝菌素。(E) 网络分析揭示了脊椎动物肠道样本和环境样本中ARG亚型与微生物物种之间的共现模式。节点根据ARG类型和物种进行着色，连接表示强相关性（斯皮尔曼相关系数ρ > 0.6）且显著（p值 < 0.05）的相关性。每个节点的大小与连接数（度数）成正比。

(A) 二元热图展示了通过宏基因组数据恢复的10种最丰富的宏基因组组装基因组（MAGs）中评估的抗性基因（灰色表示观察到的抗性，白色表示未观察到的抗性）。(B) 比较了从不同宿主群体的宏基因组中获得的含有高度相似DNA片段的ARGs。MGEs代表可移动遗传元件。

讨  论

讨  论

本研究是全球范围内收集的脊椎动物中个体数量最多的肠道微生物研究工作之一。研究结果有助于识别影响肠道微生物多样性和结构的主要调节因素。研究证实，饮食习性和气候因素在促进脊椎动物肠道微生物中特定菌群的形成方面起着关键作用。此外，本研究全面解析了脊椎动物及其同域土壤生物环境样本中常见抗生素抗性基因组，并发现了bacA基因潜在转移的证据。这些结果显著增进了我们对脊椎动物肠道微生物多样性、结构及其与环境因素关系的理解，并为更有效管理脊椎动物肠道菌群和土壤环境微生物中抗性基因库提供了数据支持和理论依据。

方  法

样本检索和筛选

本研究采用关键词和自由词相结合的方法，在PubMed、Google Scholar和Web of Science搜索文献。搜索词如下:：[“16S“] AND [“microbiome” or “microbiota”] AND [“V4” or “V3-V4”] OR [“16S”] AND [“microbiome” or “microbiota”] AND [“V4” or “V3-V4”] AND [“gut” or “fecal” or “intestines” or “cloaca”] OR [“16S”] and [“microbiome” or “microbiota”] AND [“V4” or “V3-V4”] AND [“gut” or “fecal” or “intestines” or “cloaca”] AND [“vertebrate” ] OR [“16S”] AND [“microbiome” or “microbiota”] AND [“V4” or “V3-V4”] AND [“gut” or “fecal” or “intestines” or “cloaca”] AND [“mammal” and “bird/avian” and “fish” and “amphibian” and “reptile” etc]。此外，还在搜索到的文献中保留了含有搜索词的参考文献。截至2022年9月，从99篇发表的文献中获得了12,640个基于16S rRNA基因测序的样本。

对上述检索筛得文献中的样本类型、扩增引物和测序方法进行了筛选，筛选条件如下：1）排除牲畜和家禽类的样本；2）只保留远端肠道或新鲜粪便的样本；3）排除近期进行过影响肠道微生物组成处理的样本，例如抗生素治疗；4）保留使用16S rRNA基因的V3-V4或V4区域扩增的样本；5）保留使用Illumina平台进行测序的样本；6）排除物种样本量小于8的样本。经筛选，6508份样本符合上述条件（图S1）。数据中包括物种名称、物种类别（纲和目）、饮食习性（食肉性、食草性和杂食性）、栖息地类型（陆地、水生和两栖）、圈养状态（野生或圈养）、受威胁状态（根据2022年7月的IUCN红色名录，最少关注：LC；近危：NT；易危：VU；濒危：EN；极危：CR；野外灭绝：EW）、采样地点、采样气候区、采样点的平均地表温度和采样年份，详见表S1。此外，我们还使用Google Scholar、PubMed和维基百科收集了113个脊椎动物物种的体型和肠道长度，并将其纳入表S2。

对于宏基因组样本的收集，本研究首先基于Ji M等人、Bahram等人和Delgado-Baquerizo等人的工作，收集到了土壤宏基因组。根据土壤宏基因组样本的采集地区，在Google Scholar和Web of Science网站上准确搜索同一地区上发表过关于脊椎动物肠道宏基因组研究的文献。截至2022年12月，本研究共获得487个脊椎动物肠道宏基因组样本和203个土壤环境宏基因组样本（图S1）。采样信息详见表S6。

16S rRNA测序分析

按照Ho等和Zhou等人的方法，对每项研究的序列数据分别进行处理，以避免通过一起分析所有研究而产生的批次效应。使用VSEARCH合并双端测序读数和质量控制。使用Cutadapt去除条形码和引物序列。对于不同的高变区序列，切除V4区域以外的高变区序列。随后，将处理后的不同高变区的扩增子序列合并以进行后续分析。我们还提供了6508个样本的测序详细信息，包括插入大小、序列数和质量控制前后的碱基数（表S10）。

使用 VSEARCH 按照标准 UPARSE 流程参数对组装的序列进行去重、排序，并以 97% 的同一性聚类到 OTU 中。使用 UCHIME（在 VSEARCH 中实现）和基于参考的组合（使用非冗余 SILVA SSU Ref 数据库作为参考）去除嵌合序列。

使用核糖体数据库项目 (RDP) 分类器为每个 16S rRNA 基因序列分配一个分类身份，并使用 70% 的置信阈值与 Silva 16S rRNA 基因数据库 (版本 SSU128) 进行比较。使用自定义脚本创建OTU表和分类表。

使用BIOM 2.1.5将对齐结果转换为生物观察矩阵（BIOM）格式。使用biom convert将元数据添加到BIOM-Format 1.3.1，以便使用QIIME2（版本2021.02）进行群落多样性分析。使用Shannon指数（衡量物种的丰度和均匀性）和Observed OTUs（反应物种数量）进行Alpha多样性计算。通过Jaccard距离（衡量群落相似性或差异性）和Bray-Curtis距离（衡量丰度信息的相似性度量）评估组间微生物群落的差异性进行Beta多样性分析。

宏基因组测序分析

在组装之前，所有宏基因组测序分析读取使用FastQC（v0.11.8）进行质量控制，并使用Trimmomatic（v0.39）进行质量修剪，参数为“ILLUMINACLIP .fa:2:40:15 LEADING:3 TRAILING:3 SLIDINGWINDOW:4:20 MINLEN:50”。通过与宿主基因组的比对，使用BWA-MEM（v2.2.1）和SAMtools（v1.6）去除宿主（人类）DNA。人类的参考基因组为Hg38（GCF_000001405.26）。使用MEGAHIT软件（v1.2.9）和默认参数将高质量的干净读段组装成重叠群。使用Prokka软件管道（v1.14.6）预测组装重叠群中的基因。使用CD-HIT（v4.8.1）将预测的基因序列聚类到同源组中，来构建非冗余基因目录。参数设置：-aS 0.9 -c 0.95 。使用Kraken2（v2.1.3）基于Standard 72GB数据库进行物种分类，并使用Bracken进行物种分类校正，得到物种丰度表。

使用ARGs-OAP（v3.2.2）流程和结构化抗生素抗性基因（SARG）数据库注释抗生素抗性基因。每个ARG亚型或类型的丰度都用每个宏基因组数据中的细胞拷贝数进行标准化（作为相对丰度），可以作为ARGs研究中的通用单位。使用ARG_ranker（v3.0.1）评估ARGs的风险等级及ARGs风险等级指数，参数为：-i $INPUT -kkdb $kraken2_standard。根据构建的风险评估框架，风险评估采用了三个标准：人类相关环境中的富集、基因移动性和宿主致病性。根据这些标准，ARG 被分为四个风险等级：不符合第一个标准的ARGs被分配到等级IV（风险最低）；符合第一个标准但不符合第二个标准的ARGs被分配到等级III；符合第一和第二个标准但不符合第三个标准的ARGs为等级II；符合所有三个标准的ARGs为等级I（风险最高）。为了评估ARG移动的潜在机制，将携带ARG的contig与ISfinder数据库和ACLAME数据库（v0.4）进行比较，来鉴定重叠群上的可移动遗传元件（MGE）。参数设置为E值截止值为1e−5、同一性 ≥ 80%和比对长度 ≥ 80%

多重回归矩阵分析（MRMs）

使用MRMs研究宿主系统发育（宿主系统发育距离以TimeTree上的分支长度衡量）、栖息地类型（水生、两栖和陆生）、饮食（食肉性、杂食性和食草性）、受威胁状态（LC、NT、VU、EN、CR）、圈养状态（野生或圈养）、气候（年平均气温）和地理位置（纬度和经度）之间的相互影响。按照上述顺序，栖息地类型编码为0到2，饮食编码为0到2，受威胁状态编码为5到1，圈养状态的二元变量设定为0（野生）和1（圈养）。针对所有独立变量分别计算群落之间的Gower距离，计算欧几里德距离以获得香农指数差异，并计算Bray-Curtis距离以估计肠道群落之间的Beta多样性。对于使用EcoDist R包的MRM，通过将实际数据与随机排列（所有分析的n=1000）进行比较来获得效应大小和显著性。

统计分析

使用Kruskal–Wallis检验（多组比较）或双尾Wilcoxon秩和检验（成对比较）比较肠道细菌群落特征。FDR校正后的p < 0.05被视为这些检验的统计显著性。使用R包“ggplot2”可视化数据分布的箱线图。不同样本的细菌群落组成和功能的变化通过基于Bray-Curtis距离的非度量多维尺度分析（NMDS）进行评估。使用R中的randomForest包进行随机森林回归，以评估不同因素对脊椎动物肠道微生物多样性的相对重要性。宿主系统发育距离通过TimeTree网站（http://timetree.org）提供的物种分支长度来衡量。地图绘制使用ArcGIS10.2软件（Environmental Systems Research Institute Inc., Redlands, USA）完成。LEfSe分析的参数设置为：：Kruskal-Wallis检验的p值小于0.05，判别特征的对数LDA得分阈值为4.0。微生物功能通过PICRUSt（版本2.5.1）推断，推断出的基因及其功能与京都基因与基因组百科全书对齐。使用STAMP（版本2.1.3）分析PICRUSt预测功能可视化，通过Welch的t检验和Storey的FDR评估显著性（报告*p < 0.05，效应量 > 0.5）。UpSet图通过UpSet服务器可视化（http://www.bioinformatics.com.cn/plot_basic_upsetR_plot_009）。

本研究分析了不同气候区域脊椎动物肠道微生物中OTUs的共现。为了减少网络复杂性并便于识别核心肠道群落，选择了相对丰度>0.1%且在超过50%样本中存在的OTUs进行分析。对于所有网络，我们对OTUs进行了Spearman秩相关分析，并基于强相关（ρ > 0.6）和显著相关（p < 0.05）探索肠道微生物群落的共现模式。还计算了每个网络的拓扑特征。这些特征包括模块性（M）、平均度（avgK）、平均聚类系数（avgCC）和平均路径长度（GD）。此外，为了研究ARGs的共现模式并识别ARGs的潜在宿主，我们使用相对丰度平均值 > 0.1%且在特定组中>50%样本中存在的菌种和前50种相对丰度ARG亚型进行分析。通过计算ARG亚型和菌种之间所有可能的成对Spearman秩相关，生成相关矩阵。如果两者之间的Spearman相关系数（ρ）>0.6且p值<0.05，则认为相关性具有统计显著性。所有网络使用Gephi版本0.9.7的Fruchtermann-Feingold布局可视化。

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“iMeta” 是由威立、肠菌分会和本领域数百千华人科学家合作出版的开放获取期刊，主编由中科院微生物所刘双江研究员和荷兰格罗宁根大学傅静远教授担任。目的是发表所有领域高影响力的研究、方法和综述，重点关注微生物组、生物信息、大数据和多组学等。目标是发表前10%(IF > 20)的高影响力论文。期刊特色包括视频投稿、可重复分析、图片打磨、青年编委、前3年免出版费、50万用户的社交媒体宣传等。2022年2月正式创刊发行！发行后相继被Google Scholar、ESCI、PubMed、DOAJ、Scopus等数据库收录！2024年6月获得首个影响因子23.7，位列全球SCI期刊前千分之五(107/21848)，微生物学科2/161，仅低于Nature Reviews，同学科研究类期刊全球第一，中国大陆11/514！

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