iMeta | 中国海洋大学张伟鹏组-海洋生物被膜抗菌肽

海洋生物被膜中的新型抗菌肽勘探

●  海洋生物被膜中的抗菌肽尚未被探索，细菌分离、培养和基因组测序为从海洋生物被膜中挖掘抗菌肽奠定了基础；

● 核糖体分析的引入增强了序列过滤过程，使得在抗菌肽预测之前能够更准确地识别sORFs；

●  基于模型的多层过滤管道在筛选候选抗菌肽时表现出出色的预测性能；

●  候选抗菌肽经验证表现出卓越的抗菌功效，具有成为候选药物的极大潜力。

引  言

抗生素耐药性已经成为一个重大的公共卫生威胁，表明目前我们缺乏有效的抗生素。因此，寻找新型抗菌药物可以作为发起与细菌竞争斗争的一种尝试。在寻找新型抗生素的过程中，抗菌肽（AMPs）作为潜在的治疗药物已经引起了极大的关注。AMPs包括动物、植物和微生物产生的各种可以对抗细菌感染的生物活性化合物。AMPs是两亲性小分子，具有广谱抗菌作用，其机制包括破坏细菌细胞膜和干扰DNA或RNA合成等。

AMPs可以通过非核糖体途径或核糖体途径合成。其中，许多由核糖体合成的无需修饰的AMPs表现出强大的抗菌活性。以往对AMPs的研究受限于其短序列和低同一性，而人工智能能够识别人类无法感知的序列特性。特别是应用深度学习技术可以从大量肽序列中提取AMPs，大大提高了新AMPs的识别能力。近年来已有研究通过多个深度学习模型系统地探索了来自人类肠道微生物组的潜在AMPs。这些肽序列通过宏蛋白质组学进一步筛选产生了2349个候选AMPs。但是，目前用于AMPs预测的管道仍有很大的改进空间，特别是在识别用于AMPs预测的小开放阅读框（sORFs）方面。

此外，细菌来源的AMPs仅占APD3数据库中的12%，而近40%的AMPs是人源的。任何对这些抗菌肽的耐药性都可能导致对人类免疫力的间接耐药性。因此，应从更广阔的环境中挖掘AMPs。由于水生生境中的高盐度、低温和有限的营养，生活在这种环境中的细菌经常产生具有独特结构和功能的代谢物。特别是海洋细菌产生的AMPs的多样性和功能还有待彻底研究。此外，海洋细菌中已经开发出了有效对抗真菌和耐药病原菌的药物，其作为天然产物和潜在药物的储存库发挥着至关重要的作用。

在海洋环境中，生物被膜是附着在任何浸没基质上的微生物群落，如人造基质、石头表面、微塑料或动物内脏。一项全球海洋生物被膜调查显示，生物被膜物种多样性远高于浮游微生物，相关细菌中多达60%的基因功能未知。特别是沿海岩石表面的生物被膜，潜藏了具有丰富生物合成潜力的微生物。而在微塑料上的生物被膜附着了具有很强运动性和抗生素抗性的微生物。此外，生物被膜内更多的信号转导途径表明，生物被膜相关细菌之间的相互作用比自由生活细菌之间的相互作用更强。因此，生物被膜相关细菌很可能在争夺领域的过程中产生代谢物作为防御，这表明其具有发现新AMPs的极大潜力。   

相关组学资源（基因组、转录组和蛋白质组数据）和缺乏合适工艺限制了从海洋生物被膜中提取AMPs。在目前的研究中，我们从海洋生物被膜中进行了大规模的细菌菌株分离并对它们的基因组进行测序。随后我们使用了一种新的方法从基因组中寻找潜在的AMPs，即将核糖体分析（Ribo-seq）与深度学习模型相结合。本研究表明使用Ribo-seq从包含许多不同菌株的复杂群体中鉴定和分离表达sORFs是有价值的。为了实现AMPs的挖掘，我们构建了一个由卷积神经网络、双向长短期记忆层和注意力层组成的深度学习模型。通过采用“由粗到细”的过滤流程实现AMPs的有效预测，并获得了具有强抗菌性能和低细胞毒性的潜在AMPs。

结  果

细菌菌株来自微塑料（MP）和岩石（ST）表面两种不同形式的沿海海洋生物被膜。在稀释并将环境微生物样品在琼脂平板上进行细菌分离时，频繁观察到特定菌株建立的菌落存在生长延迟，随后被其他菌株覆盖（图 S1）。这一现象促使我们采用两种不同的方法分别培养这些菌株。在收集了 MP 和 ST 生物被膜样品后，按照梯度稀释法，使用传统的琼脂平板划线法对细菌菌株进行分离（图 1A）。同时，样品还使用基于极限稀释策略的单细胞分离方法进行菌株分离（图 1A）。扫描电子显微镜（SEM）观察结果表明这些分离菌株为单克隆菌落（图 S2）。通过菌株分离总共获得了3842条16S rRNA基因序列，包括700条来自琼脂平板分离的MP菌株的序列，901条来自单细胞分离的MP菌株的序列，以及843条琼脂平板分离的ST菌株的序列， 1398条来自单细胞分离的 ST 菌株的序列（图 1B）。在对扩增子序列变异（ASV）进行分类后，获得了465个来自MP生物被膜的ASV，其中仅15个在平板和单细胞分离的MP菌株之间共享。类似地，ST生物被膜中获得了582个ASV，其中仅有11个是两种方法共有的（图 1C）。此外，我们对16S序列数与以97%相似度聚类的各自的操作分类单位（OTU）之间进行了稀疏分析。结果表明，单细胞培养法显著提高了从琼脂平板培养中获得的菌株数量（图 S3）。但与此同时，大多数物种仍需进行培养。

根据16S rRNA基因序列相似性分析，465 株来自 MP 和 582 株来自 ST 的非冗余菌株进行基因组测序。经质控后获得了335个高质量的MP基因组和378个高质量的ST基因组（完整度 > 95%，污染 < 5%）。重要的是，MP和ST 生物被膜中提取的细菌基因组之间完全没有相似性。两个环境中超过50%的基因组完整度超过99.5%，污染度低于0.5%（图 1D）。关于基因组大小，MP细菌的基因组大小在2.5-6.4 Mb间，ST细菌的基因组大小在2.5-6.5 Mb（图 S4A）。对于MP细菌，contigs的数量范围在1-205间，而ST细菌的数量范围在1-167间（图 S4B）。此外，MP和ST基因组的最大contig长度分别达到4.4 Mb和5.1 Mb（图 S4C），平均contig N50分别为1.0 Mb和1.5 Mb（图 S4D）。基因组的平均核苷酸相似性（ANI）分析结果表明，所有成对基因组之间的ANI均低于99.9%（图 S5A）。在253,828对基因组配对中237,106对（93.4%）的ANI值低于76%，表明基因组差异显著（图 S5B）。

随后，使用基因组分类数据库（GTDB）对基因组进行分类注释。在门水平上（对于变形菌门的分类则是纲水平），这些菌株被分配到α变形菌纲、γ变形菌纲、拟杆菌门、厚壁菌门和放线菌门（图 1E）。MP和ST分别有138和166个基因组（共304个，占所有菌株的42.6%）无法分类到种水平（图 1E）。分离的菌株分布在44个科中，其中许多科是海洋环境特有的（图 S6）。在属水平上，Qipengyuania、Psychrobacter 和 Pseudoalteromonas 是过度代表的分类群（图 S7）。韦恩图分析比较了来自 MP 和 ST 的细菌，表明这两种环境中不仅存在许多不同的分类群，还存在一些共享的科和属（图 S8）。此外，通过预测713个基因组的开放阅读框（ORF）并通过京都基因与基因组百科全书（KEGGs）进行注释，从而进一步揭示分离细菌的功能新颖性。对于MP和ST菌株，每个基因组的中位ORF值分别为3320和3429（图 S9A）。每个基因组的注释ORF中位值分别为1766和1891（图 S9B），注释率的中位数分别为54.4%和55.7%（图 S9C）。

图1. 从海洋生物被膜中收集细菌菌株及基因组测序

（A）使用两种方法收集和储存海洋生物被膜细菌的工作流程。生物被膜来源于微塑料（MP）和岩石（ST），通过基于琼脂平板和单细胞分离方法分离菌株；（B）使用基于琼脂平板和单细胞分离方法从MP和ST上的生物被膜分离细菌时生成的16S rRNA基因数量；（C）通过两种分离方法生成的非冗余16S rRNA序列的韦恩分析；（D）基因组的完整度和潜在污染度情况；（E）基于基因组分类数据库无法分类到物种水平的基因组的门水平组成和百分比。

整合Ribo-seq和深度学习的流程

图2A显示了从713个海洋生物被膜菌株基因组中预测AMPs的流程。我们从公共数据库（APD3、DBAASP、dbAMP和DRAMP）中筛选了4025条AMPs序列，这些AMP中大部分是在动物中发现的（图S10），主要的细菌来源的AMP是厚壁菌门（Firmicutes）和放线菌门（Actinobacteria）（图S10）。我们基于此数据采用神经网络算法开发了四个模型（图S10）。首先我们训练并使用了一维卷积神经网络（CNN）模型作为其他模型训练的基础（图S11A）。在第二个模型上引入了注意力层（Attention）以捕捉关键的序列特征和信息（图S11B）。为了评估肽中不同位置氨基酸之间的潜在相互作用，通过引入两层双向长短时记忆网络（BiLSTM）增强初始模型获得了第三个模型，这些层可以同时考虑肽的时间依赖性和全局序列信息（图S11C）。最后，建立了一个整合了CNN、BiLSTM和Attention层的混合模型，以进一步提高计算效率和预测准确性（图S11D）。模型测试结果显示，混合CNN-BiLSTM- Attention模型的精度最高（92%），相比其他模型精度提高了3%-9%（图2B）。该模型还展现出极高的准确率（98%）和马修斯相关系数（MCC，87%）（图2B）。四个模型的混淆矩阵显示，混合模型在精度和召回率之间达到了最佳平衡（图2C）。此外，基于精度-召回曲线下面积（AUPRC）的排名进一步证实了CNN-BiLSTM-Attention模型在综合性能方面表现更佳（图2D）。我们还通过使用相同的测试数据集评估了我们的CNN-BiLSTM- Attention模型与其他现有模型的效能。结果表明，我们的模型在准确率、精度和MCC方面均优于其他模型（图S12）。因此，选择CNN-BiLSTM- Attention模型来进行后续的AMP预测。

在预测候选AMP之前，使用EMBOSS工具预测生成了88,358,942条小开放阅读框（sORFs）。其中45,384,259个sORFs来自MP菌株，42,974,683个来自ST菌株。对于MP和ST生物被膜，去重后分别得到了33,491,575个和33,985,363个非冗余sORFs。为了判断sORFs是否真实表达，我们采用了Ribo-seq分析技术。通过将来自同一生物被膜生态位的菌株合并，创建了两个合成群落，分别生成了25.20 Gb和27.32 Gb的Ribo-seq数据集（表S2）。将Ribo-seq数据映射到细菌基因组，以调查合成群落中所有菌株的存在情况（图S13）。所有基因组均成功匹配，每个基因组都招募了超过200条序列（图S13），表明所有菌株都存在于合成群落中。随后，将Ribo-seq数据映射到前一步生成的非冗余sORFs中，在MP和ST生物被膜中分别得到了78,454个和72,542个表达的sORFs，共得到150,996个非冗余序列。基于AMP通常表现出的两亲性阳离子特性，我们计算并最终筛选出80,430个净电荷大于2的序列用于候选AMP的预测。这80,430个序列分布在44个细菌家族中，其中Alteromonadaceae家族最为常见，占23%；其次是Rhodobacteraceae（21%）、Flavobacteriaceae（15%）和Sphingomonadaceae（10%）（图S14）。

图2. AMP识别工作流程及深度学习模型评估

（A）从海洋生物被膜中发现候选AMP的完整工作流程。从海洋生物被膜中分离出非冗余的细菌菌株并对其基因组进行测序。通过结合基因组学和Ribo-seq分析从基因组中鉴定出小开放阅读框（sORFs）。使用新开发的深度学习模型对鉴定出的sORFs进行评估。最终通过实验验证了60种预测AMP的活性和细胞毒性；（B）四个模型的准确性、精确度、召回率和马修斯相关系数（MCC）；（C）混淆矩阵，用于可视化标记的AMP与预测AMP之间的相关性。“N”和“P”分别表示阴性和阳性样本；（D）精确-召回曲线下面积（AUPRC）结果。CNN-BiLSTM-Attention模型获得了最高得分（0.9500）。

候选AMPs的序列特征

通过深度学习模型从80,430个小开放阅读框（sORFs）中识别出341个序列作为候选AMPs。图3A展示了候选AMPs、输入的sORFs（用于AMP预测的表达和带正电的sORFs）及编码序列（CDS）在细菌系统发育树中的分布模式。尽管候选AMPs分布在不同的分支上，但可以观察到它们在某些特定分类群中的富集现象（图3A）。此外，这些潜在的AMPs分散在33个不同的细菌家族中，其中以红杆菌科、海杆菌科和黄杆菌科最为常见（图S15）。有趣的是，这里发现的许多家族（如嗜盐单胞菌科、盐球菌科和一些未命名的家族，如DSM-18226和HB172195）之前并未记录过会产生AMPs。关于序列的新颖性，85%的候选AMPs与训练数据集中已知AMPs的序列相似性低于40%，最高也仅为50%（图3B）。在这些候选AMPs中，Met、Arg、Trp、Cys、His和Ser的残基比训练数据集中的残基高出1.58到6.47倍（图3C）。这些AMP的物理和化学性质（如整体疏水性）也与训练数据集中的显著不同（图3D）。例如，海洋生物被膜候选AMPs的整体疏水性和疏水比率低于训练数据集中的AMPs（图3D）。此外，来源于MP和ST的AMPs在序列相似性（图S16）、氨基酸频率（图S17）和序列物理化学特性（图S18）方面表现出一致的特性，表明AMP的特性可能不受生物被膜生态位的影响。这些发现表明，我们的模型可以准确识别AMPs，并且捕捉到了潜在的序列特性。候选AMPs与之前已识别的AMPs在序列相似性和特定的分类学关系上的差异，暗示了来自海洋生物被膜细菌的AMPs具有高度独特性。

图3. 预测的候选AMPs在细菌系统发育中的总体分布概况及其序列特征

（A）候选AMPs（Cand-number）和小开放阅读框（sORFs）在从海洋生物被膜中分离的713个非冗余细菌菌株科水平的分布。该系统发育树基于全基因组数据构建。最外层的环表示通过深度学习模型预测的候选AMPs（n = 341）的分布。第二层环表示作为深度学习模型输入的sORFs（n = 80,430）的分布。图中还展示了sORFs数量、编码序列（CDS）数量、基因组大小、细菌来源及科水平的分类信息；（B）预测的AMPs与训练数据集中的AMPs之间的相似性；（C）预测的AMPs与训练数据集中的AMPs在氨基酸频率上的差异；（D）序列特性的比较，包括预测AMPs和训练数据集中AMPs的整体疏水性及疏水力矩、净电荷、电荷密度、等电点、不稳定指数、芳香性、Boman指数、脂肪族指数及疏水比例，长虚线代表中位数。

抗菌效果和细胞毒性

从前100的候选AMPs序列中随机选择60个进行化学合成，以验证这些候选AMPs的功能。我们检测了这些AMPs对八种致病细菌的抗菌效果，包括三种革兰氏阳性细菌：Staphylococcus aureus ATCC 12600、Bacillus subtilis ATCC 23857和Micrococcus luteus ATCC 4698，以及五种革兰氏阴性细菌：Escherichia coli ATCC 11775、Acinetobacter baumannii ATCC 19606、Salmonella bongori ATCC 43975、Vibrio alginolyticus xv22和Vibrio owensii ems001。其中几种细菌被标记为多重耐药菌株（见表S4）。在60个候选AMPs中有54个显示了至少对一种细菌的抗菌活性，达到90%的有效率（图4A）。我们选择了12个具有广谱强效抗菌效果的候选AMPs来进一步测定最小抑菌浓度（MIC）。每个AMP都至少对一种细菌展现了高效抑制作用（MIC ≤ 32 μg/mL）（图4B）。其中有8个AMP对上述细菌病原体中的至少一种表现出极强的抑菌效果（MIC ≤ 8 μg/mL）（图4B）。此外，Cand-217和Cand-77这两个AMP对几乎所有细菌株都表现出抗菌活性，MIC值均 ≤ 32 μg/mL（图4B）。尤其是，Cand-217对多重耐药菌株S. aureus的MIC低至2 μg/mL（图4B）。此外，还评估了上述12个候选AMPs对人类正常结肠上皮细胞（NCM-460）的细胞毒性（图4C）。候选AMPs在不同浓度下进行了细胞毒性试验，并估算了各自的CC50值。12个AMPs中有6个（Cand-214、Cand-44、Cand-5、Cand-144、Cand-53 和 Cand-210）表现出低细胞毒性（CC50 > 128 μg/mL）（图4C），表明它们具有良好的药物开发潜力。此外，还研究了不同AMP浓度对绵羊红细胞的溶血情况（图4D）。在研究的12个AMPs中，仅有2个（Cand-102 和 Cand-71）在64 μg/mL浓度下显示出超过10%的溶血率（图4D）。12个AMPs中，有6个（Cand-217、Cand-214、Cand-5、Cand-53、Cand-82 和 Cand-210）在128 μg/mL浓度下的溶血率低于10%（图4D）。这些结果表明候选AMPs对动物细胞的毒性极低。

图4. 候选AMPs（Cand-number）的抗菌效果和细胞毒性

(A) 60个AMPs对8种致病菌株的抗菌效果。通过比较使用AMP（200 μg/mL）和对照组（不使用AMP）细菌生长的细胞密度来评估AMP的抑制效果。气泡的大小代表细菌密度，气泡的颜色代表通过t-test检验生成的p值；(B) 12个候选AMP的最小抑菌浓度（MIC）；(C) 12个候选AMP对人类正常结肠上皮细胞（NCM-460）的细胞毒性。实验使用3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5二苯基四唑溴化物（MTT）方法进行，图中显示CC50值；(D) 不同浓度的AMP对绵羊红细胞的溶血实验。所有实验均采用三次独立的生物学重复进行。

抗菌机制

为了探究候选AMPs的抗菌机制，我们使用AlphaFold2预测了4个具有强抗菌活性的AMPs（Cand-44、Cand-144、Cand-214 和 Cand-5）的结构。Cand-44、Cand-144和Cand-214预测为常规α-螺旋结构，而Cand-5检测到部分α-螺旋结构，还包含随机卷曲（图S19）。这四个AMPs的α-螺旋结构还得到了预测的氨基酸序列螺旋轮图的进一步支持（图S20）。特别是，Cand-44的螺旋结构的一侧主要是极性残基，而另一侧主要是疏水性残基（图S20）。随后，通过圆二色光谱仪（CD）进一步研究了四种肽的二级结构（图5A）。在模拟细胞膜条件的30%三氟乙醇（TFE）溶液中，Cand-44、Cand-144和Cand-214显示出典型的α-螺旋结构（图5A），与AlphaFold2的预测结果一致。基于现有对α-螺旋结构AMPs的理解，我们认为其可能靶向细菌细胞膜。使用扫描电子显微镜（SEM）观察四种AMPs（5 × MIC）处理后的S. aureus ATCC 12600形态结构（图5B）。SEM结果显示，经AMP处理后细菌细胞膜结构发生明显变化，出现明显皱缩破损（图5B）。此外，通过使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察暴露于四种AMPs（1 × MIC）下并经膜染料FM4-64和核酸染料DAPI染色后的S. aureus ATCC 12600（图5C）。结果显示，AMPs对DAPI染色的核酸没有影响，但FM4-64信号显著减弱（图5C）。这些发现表明，这四种AMPs很可能靶向S. aureus ATCC 12600的细胞膜。

图5. 圆二色光谱（CD）研究及对S. aureus ATCC 12600作用的电镜观察

(A) 四个AMP在30%三氟乙醇（TFE）溶液（上图）和水（下图）中的CD光谱；(B) 扫描电子显微镜（SEM）图像，显示未处理（对照）和经AMP处理的S. aureus ATCC 12600细胞膜状态；(C) 荧光显微镜图像，显示未处理（对照）和经AMP处理的S. aureus ATCC 12600。细菌经FM4-64和DAPI染色，合并的图像包括FM4-64场、DAPI场和明场。CD研究中所有AMP的使用剂量为20 μM，SEM观察中的剂量为5×MIC，荧光显微镜观察中的剂量为1×MIC。

讨  论

本研究基于大规模细菌分离和基因组测序，首次从海洋生物被膜中系统地挖掘候选AMPs。我们还提出了一个结合核糖体分析和深度学习的新流程，用于识别候选AMPs。

尽管通过宏基因组学揭示了与海洋生物被膜相关的微生物的基因组信息，但这些基因组通常完整度较低。此外，不可培养细菌阻碍了进一步关联其他组学信息，如蛋白质组和转录组学。这些挑战促使我们从海洋生物被膜中进行细菌分离。来自两个生物膜生态位（即MP和ST）的ASV之间的重叠较少，这表明MP和ST表面的物理和化学特性在生物被膜群落的组装过程中可能选择了不同的物种，某些在原位海洋环境中稀有的物种可以在实验室条件下分离和培养。基于这一假设，我们推测海洋生物被膜生态位中仍有许多未培养的新物种。我们的结果表明，使用两种互补的分离方法（即平板划线和单细胞分离）增强了非冗余菌株的培养。细菌的生长状态可能是这两种方法之间产量重叠较少的原因。区分海洋生物被膜衍生细菌并促进其分离的一个重要表型可能是其形成菌落或浮游生长的能力。本研究中的细菌菌株和基因组资源为从海洋生物被膜中鉴定AMP奠定了基础。

从基因组中预测sORFs可能会生成大量的假阳性sORFs，尽管理论上蛋白质组学可以检测小肽，但通常检测深度较低，仅能捕获10-20%的肽，因此具有一定的挑战性。此外，蛋白质组学通常被来自优势微生物种群或保守基因家族的丰富蛋白质所覆盖，这个问题不可能通过加快或延长质谱扫描时间来解决。上述问题在复杂的微生物群落如海洋生物被膜中尤其明显，这将会导致大量数据丢失。另一方面，Ribo-seq可以直接检测由核糖体保护的RNA片段，并提供当前正在翻译的肽序列的时间视图。Ribo-seq是在Illumina平台上进行的，因此可以提供高通量数据集。我们的结果表明Ribo-seq可以从所有预测的可能sORFs中恢复0.1709%的小肽，恢复率高于以前使用的蛋白质组学方法。

在利用Ribo-seq之后，我们开发了一个用于AMP预测的深度学习模型。我们构建了多个序列特征识别模型，在考虑了各种架构的可能注意力偏差和泛化能力后确定了最佳模型。该模型通过结合CNN、两个BiLSTM层和Attention层，为AMP预测提供了一个有效的流程。单个CNN模型在预测准确性方面表现不佳，增加序列特征收集层的数量可以提高模型的预测性能。此外，当多个层一起使用时精确度可达到92%。值得注意的是，在最终预测中获得的大多数341个候选AMP序列与训练数据的相似度小于40%，且显著地包含更多的Trp和Arg，这些氨基酸被认为与抗菌特性相关。这些特性表明我们的模型不仅仅依赖氨基酸特征或序列相似性。在训练算法的数据集中，只有很少一部分序列来自海洋栖息地，这进一步支持了模型准确识别未知序列的能力。我们的研究结果表明，单个多层模型可以准确且成功地识别潜在的AMPs。这种工具适用于分析包含天然海洋栖息地微生物的数据集。此外，来自MP和ST的AMP序列特征相似，表明生物被膜生态位类型（例如不同MP材料上的生物被膜）对AMP挖掘影响不大。

在生物信息学预测之后，合成的候选AMP分子对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌表现出强大的抗菌效果。其中，S. aureus是世界卫生组织认定的四大食源性病原体之一。在本研究我们用于测试的细菌中部分为临床上的耐药菌株，大多数AMP对人类细胞的毒性较低，表明它们靶向细菌细胞的特定成分，因此这些来自海洋生物被膜的AMPs可能成为抗击抗生素耐药性的潜在治疗候选药物。此外，我们的研究表明这些AMP可能靶向细菌膜，尽管某些未知的细胞内效应也可能对其杀菌活性有贡献。总的来说，本研究通过聚焦海洋生物被膜细菌扩展了AMP分子库，并通过一种新的工作流程促进了新型AMP的发现。然而，本研究也存在一定的局限性。候选AMPs是通过化学合成的，天然产生的AMP的特性可能未得到充分复原。未来的研究方向将包括AMP的修饰（如环化和C端乙酰化）以提高其性能（如对蛋白酶消化的耐受性），随后进行动物实验以进一步评估其作为新型药物的潜力，并深入研究其抗菌靶标。

结  论

该研究成功将Ribo-seq分析与新的深度学习算法相结合，从713株纯培养的海洋生物被膜细菌中预测出抗菌肽（AMPs），并最终鉴定出341种与已知AMPs序列相似度较低的AMPs。通过合成和实验验证，确认其中90%的AMPs具有抗菌活性。机制研究表明，这些AMPs的强效活性可能是通过破坏细菌细胞膜实现的。因此，来自海洋生物被膜的可培养细菌代表了一种具有潜在药用价值的抗菌肽宝库。

方  法

海洋生物被膜采样和细菌分离

采样

在中国青岛沿海地区，从MP和ST表面采集生物被膜样本。七种类型的微塑料（包括聚甲基丙烯酸甲酯、聚苯乙烯、聚乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚丙烯、聚苯硫醚和聚碳酸酯，直径为0.3毫米）经高压灭菌后装入尼龙网袋，浸没在海岸线附近的1-2米深的海水中。30天后将附有生物被膜的的微塑料样品带回处理。同时也对浸没在1-2米深的潮间带岩石表面的生物被膜样本进行采样。使用无菌棉签刮取生物被膜细菌并放入无菌海水中，立即转移到实验室，进行细菌分离。

基于琼脂平板的菌株分离和鉴定 

从MP和ST生物被膜中收集的细菌经系列稀释（10、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷倍）后接种到Marine Agar 2216E培养基（BD Difco，美国）上。在培养箱（江南仪器厂，中国）中25°C下培养，在第3-10天选择单个菌落在解剖显微镜（Motic China Group，中国）下观察其形态特征。选择性地挑选不同类型的菌落，并在琼脂平板上进行至少五次纯化培养。将菌落被转移到液体Marine Broth 2216E培养基（BD Difco，美国）中，继续培养16小时。收集一半的细菌用于DNA提取，另一半保存于-80°C。细胞通过加热至100°C处理5分钟提取DNA，随后使用通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）扩增16S rRNA基因并进行全长Sanger测序。最终成功构建单峰信号的16S rRNA基因序列视为纯培养菌株被保留以供进一步分析，相应的菌株被保存于-80°C。

单细胞菌株分离与鉴定 

单细胞分离是基于广东生物探索有限公司（中国）采用的极限稀释法进行的。MP和ST生物被膜中的细菌悬浮于Marine Broth 2216E培养基后经流式细胞仪测定细胞密度。细胞被稀释至大约每毫升一个细菌的浓度，使用自动加样器（BYFY-1DT8；博益生物科技有限公司，中国）将0.4毫升稀释液分配到96孔板中，此步骤确保了“一个细菌一个孔”的条件。最后，孔板用无菌封口膜密封并在25°C下培养。通过拍摄监控每天观察细胞生长情况。在第3天到第10天之间，标记所有OD600超过0.1的浑浊孔，并收集其内容物进行DNA提取和16S rRNA基因扩增。成功组装的具有单峰信号的16S rRNA基因序列最终被保留以供进一步分析。相应的菌株被视为纯培养，并储存于-80°C。

基因组测序与编制

使用CD-HIT软件（版本4.8.1）基于16S rRNA基因鉴定重复序列，并使用BLASTn进行结果验证。QIIME2脚本“multiple_rarefactions.py”、“alpha_diversity.py”和“collate_alpha.py”用于生成OTU序列稀释曲线。稀释曲线以100的间隔重复10次生成。将培养的非冗余菌株采用TIANamp基因组DNA试剂盒（天根生物科技，中国）提取DNA用于全基因组测序，对于DNA产量较低的菌株，在DNA提取过程中按照试剂盒的说明添加10 mg/mL的溶菌酶。基因组测序由中国诺禾致源使用NovaSeq 6000设备完成。每个基因组产生1-2 Gb的150 bp双端读序。使用NGS QC Toolkit（版本2.0）对序列进行质量控制，其中对FASTQ文件中的双端读序执行“IlluQC.pl”命令，采用Q20作为阈值。随后使用SPAdes（版本3.0.0）在一系列kmer（包括61、71、81、91和101）下进行高质量读序组装。组装的基因组通过CheckM2使用默认参数进行完整性和潜在污染评估。仅使用> 95%完整性和< 5%污染度的基因组进行进一步分析。使用GTDB-Tk（版本2.1.0）中的“classify_wf”命令对基因组进行分类注释。使用fastANI软件（版本1.33）移除ANI值> 99.9%的冗余基因组。分类隶属关系图使用ImageGP绘制，基于120个细菌通用标记基因集生成系统发育树，并在iTOL中可视化。对于单个基因组的分析，使用Prodigal（版本2.6.3）预测开放阅读框（ORF），提取闭合的ORF及其匹配的蛋白质序列，通过使用DIAMOND（版本0.9.14.115）将蛋白质序列与原核生物数据库进行匹配完成功能基因注释。其中蛋白质数据库（版本2022）从日本的KEGG FTP学术订阅中获取。

Ribo-seq分析与sORFs预测

从海洋生物被膜中获得的713个菌株在2216E海洋肉汤中25°C培养过夜。在细菌对数生长期使用酶标仪在OD 600 nm测定细胞密度，并用液体培养基调整至约0.2。随后将来自相同生物被膜生态位的菌株混合获得两个混合培养样品，一个由MP生物被膜菌株组成，另一个由ST生物被膜菌株组成。这些混合物被接种到新鲜的2216E培养基中，在六孔板中25°C条件下再静置培养16小时，使生物被膜在孔底部形成。随后将两种培养物离心并重新悬浮在2216E培养基中以收集细菌。之后加入放线菌酮孵育1分钟，离心并重新悬浮在含有放线菌酮的预冷磷酸盐缓冲液中孵育1分钟。离心后弃上清液，收集菌体并液氮速冻。低浓度RNase处理核糖体-新生肽链复合物，分解缺乏核糖体覆盖的RNA片段。使用诺禾致源（中国）的Illumina NovaSeq平台，对核糖体转运和保护的小RNA片段进行测序。最终，MP和ST生物被膜菌株组合分别收集了25.20 Gb和27.32 Gb的数据集。

使用Prodigal并采用默认参数对378个ST菌株和335个MP菌株的基因组进行CDS预测，并将它们分别合并为两个CDS库：ST和MP。这两个库与获得的ST和MP的Ribo-seq数据通过bowtie2（版本2.4.4）进行匹配，将与每个菌株匹配的序列数量除以总匹配序列数量，确定每个菌株的相对丰度。此外，根据菌株的系统发育分类，独立确定ST和MP中不同家族匹配的序列数量。

使用EMBOSS（版本6.6.0.0）的getorf函数从713个基因组中预测sORFs，将序列长度设置在5-40个氨基酸之间。“-find”参数设为2，采用通用细菌密码表。使用Seqkit（版本2.1.1）中的rmdup函数删除重复序列。Ribo-seq数据集通过bowtie2对齐到sORFs序列上。定义匹配碱基与匹配序列长度比 ≥ 2的序列为表达的sORFs。

从公共数据库中收集抗菌肽序列

AMP 

AMP序列从四个公共数据库中收集，包括APD、DBAASP、dbAMP和DRAMP，这些数据库涵盖了大部分来自动物、植物、微生物和真菌的AMP序列（截至2023年10月12日）。将所有收集的序列（n = 13,405）压缩为一个数据文件，随后删除了小于5个氨基酸或大于40个氨基酸的序列，以及不包含抗菌活性标签的序列，如只有抗真菌或抗癌活性标签的序列。最终获得了总计4025个非冗余的AMP序列。

非AMP

具有非抗菌肽活性的肽序列从UniProt数据库（http://www.uniprot.org）下载。过滤掉标记为抗菌、抗生素、抗病毒、抗真菌、效应蛋白或分泌物的序列后，仅保留了长度小于或等于40个氨基酸且标记为无抗菌活性的序列。使用CD-HIT去除重复序列，并删除与AMP数据集中相同的序列，最终生成了包含40,291个序列的非AMP数据。

数据集划分

包含AMP和非AMP序列的数据集被分为三组：训练集、验证集和测试集，划分比例为6:2:2。训练集和验证集用于优化模型性能及超参数选择。测试集与训练集和验证集相独立，仅用于模型最终性能测试。

模型构建与评估

将所有AMP和非AMP中的肽序列转换为计算机可读的标准化格式：1) 20种不同的氨基酸被转换为相应的数字；2) 对于长度少于40个氨基酸的序列，末尾添加“0”以将所有序列固定为40个氨基酸；3) 对于序列标签，用“1”表示序列为AMP，，而对于non-AMP用“0”表示。

使用TensorFlow（版本2.11.0）构建了四种基于神经网络的模型。所有模型的初始层都是嵌入层，用于将序列转换为嵌入向量。在CNN模型中，嵌入层后是一个一维卷积层和一个池化层，用于提取序列信息。然后使用了两个带有ReLU激活函数的全连接层。内部的L2正则化被调整为0.02，并使用sigmoid激活函数来生成预测结果。在CNN-BiLSTM模型中，在CNN模型的基础上添加了两层BiLSTM，BiLSTM单元中的L2正则化设置为0.02，然后使用两个全连接层进行输出。在CNN-Attention模型中，在CNN模型的基础上，在卷积池化层后添加了一个dropout层。然后引入Attention层和全连接层。最后，CNN-BiLSTM-Attention模型通过整合CNN、BiLSTM和Attention层来创建多层结构模型。该模型由卷积池化层、dropout层、两层BiLSTM层、Attention层和三层全连接层组成。

所有模型使用二元交叉熵损失函数，优化器选择为ADAM，除学习率设为1e-4外，其他均为默认值。超参数的选择通过随机搜索法完成。嵌入层中的神经元数量在64-128的范围内变化。卷积层的单元数、核大小和步幅在64-128、2-8和1-8的范围内变化。池化层的核大小和步幅为2-8。CNN模型的第一个前馈神经网络层配置为20-100个单元，第二个前馈神经网络层为20-64个单元。CNN-BiLSTM模型配置的大小为64-128和20-64。CNN-BiLSTM-Attention模型的CNN层配置为64-256，BiLSTM层为20-64。CNN-Attention和CNN-BiLSTM-Attention模型的dropout率为0.1至0.3。CNN和CNN-Attention模型训练100个epoch，而其他模型训练30个epoch。随机搜索的迭代次数设置为200次，并应用五折交叉验证。所有模型使用批大小为64进行训练。为尽量减少训练期间的过拟合，采用了耐心值为5的早停策略。所有模型在训练过程中表现出快速收敛。所有模型的预测概率阈值设置为0.5，预测概率大于0.5的为AMP，小于等于0.5的为non-AMP。

通过TensorFlow计算混淆矩阵来测试不同模型的性能。利用scikit-learn（版本1.2.2）计算准确率、精确率、召回率和MCC评估参数。这些系数通过混淆矩阵中的真正例（TP）、真负例（TN）、假正例（FP）和假负例（FN）来评估模型。

在scikit-learn库中，使用精确率-召回率曲线下的面积（AUPRC）作为评估指标，以展示不同分类水平下精确率和召回率之间的平衡，AUPRC还可以评估模型在处理类别不平衡数据集时的有效性。此外还通过当前研究测试集比较了我们的模型与此前已发表的模型（AMPActiPred、Amplify、Macrel、CAMP、AMP Scanner、AMPpred-MFA、AMPfun、Ampir）之间的预测性能。

候选AMP的预测及序列特性分析

在评估预测模型之前，先对Ribo-seq揭示的肽序列的净电荷进行计算。将带正电的氨基酸（赖氨酸、组氨酸和精氨酸）电荷记为1，带负电的氨基酸（谷氨酸和天冬氨酸）电荷为-1，中性氨基酸的电荷为0。序列净电荷大于2的肽被用作CNN-BiLSTM-Attention预测模型的查询序列。将预测得分大于0.5的肽视为候选AMP。根据序列相似性和氨基酸频率，将候选AMP与训练数据集中的AMP进行了比较。序列相似性通过使用EMBOSS函数的默认参数进行评估。序列特性变化，包括全局疏水性和疏水矩、净电荷、电荷密度、等电点、不稳定指数、芳香性、脂肪族指数、Boman指数和疏水比，部分参数通过modlamp软件包（版本4.3.0）中的GlobalAnalysis和GlobalDescriptor进行评估。

肽合成与抑菌实验

使用Sangon Biotech（中国）的Fmoc固相合成技术合成AMP，并通过质谱和高效液相色谱检测AMP的分子量和纯度，每种肽的纯度均超过95%。获得的肽冻干粉末溶于超纯水中形成2 mg/mL的溶液。

抗菌实验中使用了八株细菌：S. aureus ATCC 12600、B. subtilis ATCC 23857、E. coli ATCC 11775和A. baumannii ATCC 19606购自上海北诺生物（中国）。M. luteus ATCC 4698和S. bongori ATCC 43975购自上海北思生物技术（中国）。来V. owensii ems001和V. alginolyticus xv22来自我们实验室从患病虾肠道分离的。所有菌株在37°C下使用阳离子调节的Mueller-Hinton肉汤（CAMHB）培养至对数生长期（OD600 = 0.5），然后使用新鲜的CAMHB将细菌梯度稀释至5 × 10⁵ CFU/mL的细菌密度。抑菌实验在96孔板中进行（最终肽浓度为200 μg/mL）。共设置四个实验组，包括空白对照组（200 μL CAMHB）、阴性对照组（180 μL CAMHB加20 μL肽）、阳性对照组（180 μL细菌培养液加20 μL超纯水）和实验组（180 μL细菌培养液加20 μL肽）。每组均进行三次生物重复，在37°C孵育12小时后测量OD600值。每个观测值均从空白对照组的值中减去。然后从阴性对照组值中减去实验组的值，以消除肽对OD测量的影响。使用t-test检验评估实验组与阳性对照组之间的差异，p值小于0.05认为存在显著差异。通过一组不同肽浓度（0.5到200 μg/mL）实验来进一步评估MIC，肽对细菌的MIC定义为无可见细菌生长的最低肽浓度。

细胞毒性实验

人正常结肠上皮细胞（NCM-460）购自北纳细胞库（中国）。细胞毒性通过3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四唑溴化物（MTT）法进行测定。NCM-460细胞在Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)-H完全培养基（90% DMEM-H，10% FBS，10,000 U/mL青霉素和10,000 μg/mL链霉素）中培养至对数生长期。将细胞悬液以10⁵个细胞/100 μL/孔的浓度制备在96孔板中。将肽溶解于DMEM-H培养基中制备25 mg/mL的储备溶液，稀释至4-512 μg/mL的多个梯度，将稀释后的肽（100 μL/孔）加入到96孔板中的细胞中。DMEM-H培养基作为空白组，细胞悬液作为对照组，细胞悬液与肽的混合物作为实验组。每组进行三次独立重复。经过48小时培养后，向每个孔中加入10 μL的MTT，并在37°C下继续孵育4小时。随后加入100 μL的Formazan溶液，并在37°C下再孵育4小时，直到所有紫色晶体溶解。测量OD570的吸光度。细胞活力通过以下公式计算：

最后使用在线工具（https://www.aatbio.com/tools/ic50-calculator）计算CC50值。

溶血实验

新鲜采集的羊血在3000 rpm下离心10分钟去除上清液。用生理盐水将沉淀物洗涤并重悬，制备成2%的血细胞悬液。然后将400 μL肽溶液加至100 μL的2%血细胞悬液制备成最终肽浓度为8、16、32、64和128 μg/mL。生理盐水和2%的Triton X-100生理盐水分别作为阴性和阳性对照。样品在37°C水浴中孵育1小时，随后在3000 rpm下离心10分钟。然后将200 μL上清液转移至96孔板中并在545 nm波长下测量OD值。每个样品的溶血率通过以下公式计算：

AMP结构预测

使用ColabFold预测AMP的结构，设置num_relax=1，template_mode=pdb100，msa_mode为mmseqs_uniref_env，pair_mode为unpaired_paired。使用在线软件Heliquest（https://heliquest.ipmc.cnrs.fr/cgi-bin/ComputParams.py）计算肽的螺旋轮投影。

CD光谱测量

肽溶液使用30% TFE或超纯水制备，保持最终浓度为20 μM。CD测量在圆二色光谱仪（Jasco Circular Dichroism Spectrophotometer J-1500，日本）上进行。使用路径长度为1 mm的石英池，测量波长范围为190–260 nm。扫描速度为200 nm/min，带宽固定为1 nm。使用Means-Movement平滑过滤器处理光谱数据，并使用Spectra Manager的二级结构估计功能来估计二级结构。

SEM和CLSM测量

S. aureus ATCC 12600在LB培养基中37°C过夜培养，稀释至108 CFU/mL。向细胞悬液中分别添加AMP（最终浓度为 5 × MIC），在37°C下孵育1小时，同时将未处理的S. aureus ATCC 12600作为对照。随后样品在室温下以 4000 rpm 离心5分钟，去掉上清液后将沉淀重悬于PBS（pH 7.0）中。经过两次PBS洗涤后将细胞沉淀用2.5%的戊二醛溶液固定。将细菌涂布在载片上，使用100%乙醇干燥两次，并依次用30%、50%、70%、80%和100%乙醇处理十分钟。之后用异戊醇替换样品。经过二氧化碳的临界点干燥和金属喷涂处理后，样品通过扫描电子显微镜（Tescan Vega3，捷克）观察。

S. aureus ATCC 12600在LB培养基中过夜培养后，调整OD至 0.6。细胞用1×MIC的肽处理并在37°C下培养40分钟。然后加入1 μg/mL的FM4-64，混合物在冰上孵育 40 分钟。随后加入20 μg/mL的PI和2 μg/mL的DAPI，再次在冰上孵育15分钟。然后通过3000 rpm 离心6分钟收集细胞并重悬于LB培养基中。细胞悬液在玻璃载片上空气干燥，并用抗褪色装载介质进行封装。样品在中国海洋大学方宗熙中心通过共聚焦激光扫描显微镜（Zeiss LSM980，德国）观察。

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“iMeta” 是由威立、肠菌分会和本领域数百千华人科学家合作出版的开放获取期刊，主编由中科院微生物所刘双江研究员和荷兰格罗宁根大学傅静远教授担任。目的是发表所有领域高影响力的研究、方法和综述，重点关注微生物组、生物信息、大数据和多组学等。目标是发表前10%(IF > 20)的高影响力论文。期刊特色包括视频投稿、可重复分析、图片打磨、青年编委、前3年免出版费、50万用户的社交媒体宣传等。2022年2月正式创刊发行！发行后相继被Google Scholar、ESCI、PubMed、DOAJ、Scopus等数据库收录！2024年6月获得首个影响因子23.7，位列全球SCI期刊前千分之五(107/21848)，微生物学科2/161，仅低于Nature Reviews，同学科研究类期刊全球第一，中国大陆11/514！

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