iMeta | 刘杏忠团队揭示长期连作缓解烟草连作障碍的微生物机制

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作物连作往往会导致自毒物质积累、土壤酸化、病原菌富集和微生物功能紊乱，进而使得一些作物出现严重的连作障碍。本研究揭示了长期连作使烟草采取“哭救”策略，响应短期连作中自毒物质积累的胁迫而招募自毒物质降解微生物，降解自毒物质菌群的差异富集使自毒物质含量降低、土壤pH上升，从而缓解烟草连作障碍。添加10%长期连作土壤也能很好地缓解短期连作土壤的连作障碍。我们从长期连作烟草土壤中分离并获得2株自毒物质降解菌，接种到短期连作土壤能够有效缓解烟草连作障碍。利用微生物组学手段，在无菌培养和土壤条件下我们研究了2个功能菌株的自毒物质降解机制。研究结果为解决连作障碍、促进植物健康和农业可持续发展提供了新的思路。

引  言

许多植物在连作时会遭受严重的连作障碍问题，这通常是由土壤中生物和非生物因素引起的，如自毒物质积累、土壤理化性质紊乱（如pH值变化）或病原菌富集。自毒作用是造成连作障碍的重要原因之一。植物可以通过根系分泌物或降解植物残留物等途径向土壤环境释放有毒的化学物质。在植物和植物周围环境中发现的许多类型的酚酸类化合物具有自毒作用，导致连作障碍和产量损失。香兰素作为一种重要的植物自毒物质，可以显著增加土壤中病原真菌的丰度。

不少研究报道了连作给作物带来负面影响，然而一些研究表明，作物的单一长期连作对作物有积极作用，如长期单作形成的病害抑制性土壤。一些作物长期单作可以调节根际微生物的组成和功能，从而抑制真菌病原导致的病害。植物在胁迫下通过调节土壤或根际微生物群落抵抗胁迫的现象被描述为“哭救”策略，植物通过这种策略招募有益微生物，以增强其抵抗胁迫的能力从而应对环境变化。

烟草（Nicotiana tabacum L.）是世界性经济作物之一。云南省是中国最大的烟草产区，其种植模式常为每年种植烟草而间作其它作物，这种连作制度导致了严重的烟草连作障碍，主要表现为植物生长发育不良、土壤酸化和自毒物质（主要是酚酸类化合物）的积累和微生物功能失调。然而长期连作烟草后连作障碍是否能够缓解尚未研究。在对云南省烟草连作田间调查过程中，我们发现虽然在短期连作（≤ 5年）土壤存在十分严重的连作障碍，但长期连作（≥ 10年）土壤没有明显的连作障碍现象。鉴于烟草连作障碍与土壤中自毒物质的积累有关，我们推测长期连作可能使烟草招募能够降解自毒物质的微生物类群，通过降解自毒物质缓解连作障碍。我们初步研究发现，烟草短期连作土壤严重的连作障碍与土壤中酚酸含量积累有关，尤其是香草酸、香兰素和肉桂酸。香兰素对烟草种子具有毒害作用，即使是低浓度也存在这种负面影响，并且在含有香兰素的土壤中，烟草幼苗的生长受到明显的抑制作用。

结  果

长期连作烟草可调节土壤酸化、自毒物质积累和根系相关微生物群

环境胁迫可以激发植物采用“呼救”策略招募有益微生物以缓解胁迫并促进其适应环境变化。我们比较了短期连作和长期连作的田间土壤，发现长期连作自毒物质含量（如酚酸）和土壤酸化程度降低（图1A-B），从而减轻连作对土壤的负面影响。进一步对微生物群落分析发现，长期连作土壤中Pseudomonas、Burkholderia、Rubrobacter、Adhaeribacter、Comamonas、Lysobacter、Acidovorax、Variovorax属细菌和Trichoderma、Preussia、Arcuadendron、Penicillium属真菌的操作分类单元（OTU）发生了显著富集，细菌Pseudomonas（OTU_831，OTU_2553）、Rubrobacter（OTU_3186，OTU_4470，OTU_3533，OTU_9018）、Adhaeribacter（OTU_6752，OTU_6780，OTU_6878）、Comamonas（OTU_1967）、Lysobacter（OTU_1591，OTU_1786，OTU_2415）、Acidovorax（OTU_1226，OTU_2942）、Variovorax（OTU_2739）、Phaselicystis（OTU_4233）和Sorangium（OTU_3079），以及真菌Trichoderma（OTU_1474）、Preussia（OTU_2198）、Arcuadendron（OTU_1567）和Penicillium（OTU_2457，OTU_249）的相对丰度与土壤中酚酸含量呈显著负相关（图1C）。这些结果表明，短期连作大量酚酸积累激发烟草采用“呼救”策略促进能够降解酚酸的有益微生物富集。这一非生物胁迫的结果具有与长期单作诱导形成侵染性病害抑制性土壤相似的模式，即长期胁迫可以诱导作物响应胁迫的土壤稳态形成，以应对长期连作和单一连作的生物和非生物胁迫。我们的研究表明，长期连作土壤中相关微生物类群可以缓解短期连作土壤的烟草连作障碍。

微生物介导的病害抑制作用可以从抑制性土壤传导到导病土。同样地，在可控条件下，我们发现向短期连作土壤中添加10%长期连作土壤（L10）可以降低土壤中自毒物质含量，促进植物生长（图1D-E），这与自毒物质含量和细菌群落组成的变化有关（图1F）。在长期连作土壤中，Pseudomonas、Burkholderia、Rubrobacter、Adhaeribacter、Comamonas、Lysobacter、Acidovorax和Variovorax属OTU的相对丰度显著增高，这与我们之前在田间土壤中获得的结果一致。值得注意的是，Pseudomonas（OTU_17288）、Lysobacter（OTU_17914）和Variovorax（OTU_14122、OTU_14136、OTU_14118、OTU_ 14131、OTU_14137）的相对丰度与长期连作土壤中香兰素含量呈显著负相关（图1G），表明这些微生物可能降解香兰素。在L10土壤中也发现了类似的模式，Pseudomonas、Burkholderia、Comamonas、Lysobacter、Acidovorax和Variovorax属的细菌OTU存在显著差异，Pseudomonas（OTU_17295）、Burkholderia（OTU_13611）和Lysobacter（OTU_17914）的相对丰度与香兰素含量显著负相关（图1G）。这些结果表明，能够在长期连作土壤中降解自毒物质的微生物传导到短期连作土壤中并发挥缓解连作障碍的作用。这种具有降解自毒物质能力的微生物已被证明对植物生长和土壤健康具有积极作用，如Pseudomonas、Burkholderia、Comamonas、Trichoderma、Acidovorax、Variovorax、Rubrobacter、Lysobacter、Adhaeribacter和Preussia等类群可以降解酚酸类化合物、具有生物降解潜力或促进植物生长的能力。

图1. 长期连作烟草可调节土壤酸化、自毒物质积累和根系相关微生物群

（A）田间土壤中总酚酸含量；（B）田间土壤pH值；（C）长期连作土壤中差异富集的细菌类群与酚酸的相关性热图；（D）短期连作土壤（L0）、添加10%长期连作土壤的短期连作土壤（L10）以及长期连作土壤（L100）中烟草幼苗地上部和地下部干重；（E）L0、L10和L100土壤中香兰素含量；（F）L0、L10和L100土壤中细菌群落结构的主坐标分析（PCoA）；（G）自毒物质处理的L100和L10土壤中差异富集的细菌类群与香兰素的相关性热图。缩写：JBSF：间苯三酚；MSZS：没食子酸；DQJBJS：对羟基苯甲酸；LBEJS：邻苯二甲酸；XCS：香草酸；KFS：咖啡酸；DXS：丁香酸；XLS：香草醛；DXDS：对香豆酸；AWS：阿魏酸；SYS：水杨酸；BJS：苯甲酸；RGS：肉桂酸；Total：总酚酸。

自毒物质降解菌通过在土壤中的定殖和降解自毒物质从而缓解连作障碍

微生物测序数据的分析结果显示，Pseudomonas和Burkholderia类群在长期连作土壤和10%传导土壤中显著富集，且相对丰度与土壤中酚酸含量显著负相关（图1G）。我们使用以香兰素为唯一碳源的基础盐培养基从长期连作烟草土壤中分离出2个细菌菌株（NLJ1和NLJ2）。系统发育分析显示，菌株NLJ1与Pseudomonas plecoglossicida（NR114226）亲缘关系最近，菌株NLJ2与Burkholderia pyrrocinia（NR029210）亲缘关系最近。2种分离株都能在无菌培养基和短期连作土壤中高效降解香兰素（图2A，2C）。此外，在添加香兰素的短期连作土壤中，烟草幼苗的生长受到明显抑制，接种NLJ1、NLJ2或其混合液可以缓解烟草连作障碍（图2B）。将单一菌株或2种菌株混合液接种到添加香兰素的短期连作土壤中后，土壤中细菌群落结构发生了变化（图2D）。2种自毒物质降解细菌的相对丰度显著增加，表明这2种细菌可以很好地定殖并在土壤中建立种群（图2E）。进一步分析显示，Pseudomonas（OTU_14268）和Burkholderia（OTU_10908）的相对丰度与接种自毒物质降解菌的土壤中香兰素含量呈显著负相关（图2F）。

细菌对香兰素的降解机制在文献中还未有明确报道。香兰素可以通过降解酚酸或芳香化合物而发生间接降解，已知仅有少量的菌株可以直接降解自毒物质。在本研究中，我们观察到在香兰素胁迫下，在基础盐培养基进行无菌培养的自毒物质降解菌Pseudomonas和Burkholderia中与自毒物质降解相关的基因显著上调。香兰素是芳香族化合物，在土壤中的降解比较复杂，可能涉及复杂的机制。与乙醛酸和二羧酸代谢相关的基因上调在芳香族化合物的降解中具有至关重要的作用，添加香兰素后，在无菌培养基和长期连作土壤中与乙醛酸和二羧酸代谢相关的基因上调。该代谢途径可能参与了香兰素的降解，或者至少参与了细菌对香兰素诱导的应激反应。本研究不仅揭示了与Pseudomonas和Burkholderia在土壤中定殖并降解香兰素，而且证明了长期连作后烟草通过招募抵抗胁迫和降解自毒物质的微生物类群来缓解短期连作土壤的连作障碍。

图2. 自毒物质降解菌通过在土壤中的定殖和降解自毒物质从而缓解连作障碍

（A）2种自毒物质降解菌的生长曲线以及香兰素的浓度随自毒物质降解菌生长的动态变化；（B）用水（W）、香兰素（A）、香兰素 + NLJ1（A1）、香兰素 + NLJ2（A2）、香兰素 + NLJ1 + NLJ2（AM）处理的土壤中烟草幼苗地上部和地下部干重；（C）用W、A、A1、A2和AM处理的土壤中香兰素浓度；（D）W、A、A1、A2和AM处理的土壤中细菌群落结构的主坐标分析（PCoA）；（E）自毒物质及降解菌处理的短期连作烟草土壤中差异富集的细菌类群的火山图；（F）自毒物质降解菌处理的短期连作烟草土壤中差异富集的细菌类群与香兰素的相关性热图。缩写：UV：紫外线；OD：光密度。

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“iMeta” 是由威立、肠菌分会和本领域数百千华人科学家合作出版的开放获取期刊，主编由中科院微生物所刘双江研究员和荷兰格罗宁根大学傅静远教授担任。目的是发表所有领域高影响力的研究、方法和综述，重点关注微生物组、生物信息、大数据和多组学等。目标是发表前10%(IF > 20)的高影响力论文。期刊特色包括视频投稿、可重复分析、图片打磨、青年编委、前3年免出版费、50万用户的社交媒体宣传等。2022年2月正式创刊发行！发行后相继被Google Scholar、ESCI、PubMed、DOAJ、Scopus等数据库收录！2024年6月获得首个影响因子23.7，位列全球SCI期刊前千分之五(107/21848)，微生物学科2/161，仅低于Nature Reviews，同学科研究类期刊全球第一，中国大陆11/514！

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