iMetaOmics | 重庆大学王贵学组-肠道微生物细胞外囊泡在神经退行性疾病中的新作用及其治疗策略

肠道微生物细胞外囊泡在神经退行性疾病中的新作用及其治疗策略

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●  肠道菌群失调，即指肠道内细菌的异常变化，可能在神经退行性疾病的发生与发展中起着至关重要的作用；

●  肠道微生物细胞外囊泡具有作为信使的潜力，可以在肠道和大脑之间传递信息；

●  肠道微生物细胞外囊泡可能加重神经退行性疾病，但同时也具有作为创新治疗药物递送系统的潜在应用价值。

引  言

神经退行性疾病（NDs）对全球公共健康构成了重大且日益严重的威胁，影响着全球数百万人的生活。神经元的退化和死亡是神经退行性疾病的根本原因，进而导致显著的心理、认知和身体功能障碍。一些常见的ND包括阿尔茨海默病（AD）、帕金森病（PD）、肌萎缩性侧索硬化症（ALS）和亨廷顿病（HD）。由于这些疾病的复杂进程涉及多种因素，如遗传因素、环境暴露和自然老化过程，因此其诊断和治疗面临巨大的挑战。此外，线粒体功能障碍、蛋白质错误折叠、神经炎症和氧化应激（OS）在ND患者中频繁出现。与此同时，随着全球老龄化人口的增长，ND的发病率也相应增加。因此，迫切需要开发创新的治疗方法，以有效管理这些疾病。

肠道微生物（GM）是一个多样且复杂的微生物群落，栖息在胃肠道内，主要集中于大肠。这一群落包含超过100万亿的细菌，在维持人体稳定与平衡中起着至关重要的作用。这一复杂的微生物群落对多种生物过程产生显著影响，包括免疫系统的调节、食物代谢，甚至个体的心理状态。新兴研究表明，肠道微生物组成的改变可能促成AD、PD、HD和ALS等多种疾病的发生和发展。肠道微生物被认为能够通过多个通路影响大脑功能，这些通路包括免疫通路、迷走神经、循环系统、下丘脑-垂体-肾上腺轴以及淋巴和脑淋巴循环。

最近的研究深入探讨了肠-脑轴（GBA）与ND之间的重要联系。这些研究提供了越来越多的数据，表明GM与ND的发病可能存在关联。研究表明，与AD相关的GM失调可能会传递下去，导致认知功能的下降，这与Tau蛋白磷酸化水平的升高有关，而Tau蛋白磷酸化是AD的一个特征。解决AD相关认知障碍的潜在治疗方法包括通过益生菌疗法调节GM，并靶向丁酸-糖原合成酶激酶3β（GSK3β）通路。因此，肠道微生物组成和多样性的变化不仅会引发肠道相关疾病，还会导致胃肠道疾病及ND。

近年来，肠道微生物细胞外囊泡（GMEVs）作为宿主-微生物群通信的媒介引起了极大的关注。细胞外囊泡是一种由几乎所有细胞类型分泌的膜封闭颗粒，能够将不同的生物分子穿过生物屏障进行传递。尽管开展了大量研究，许多ND的病因和发展仍未完全被理解，这突显了需要对基本过程有新的认识。最新研究提供了越来越多的证据，表明微生物群及其分泌的细胞外囊泡在ND的发生与进展中发挥着作用。GMEVs可以通过特定信号途径影响大脑功能，可能通过直接穿越血脑屏障（BBB）起作用。这些细胞外囊泡因其丰富多样的蛋白质和小RNA载荷，对神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞有不同的影响。

GMEVs已展示出控制大脑基因表达并在神经炎症和神经退行性变的不同阶段引发疾病发展的能力。因此，它们在包括中风、AD、PD和痴呆在内的多种疾病中发挥直接作用。另一方面，来自特定类型的细菌，尤其是那些具有益生特性的肠道细菌所产生的GMEVs，已被证实对多种神经疾病具有特定的治疗效果。因此，GMEVs既能促成也能治疗神经病理学问题。

本研究旨在探讨GMEVs在ND中的功能和作用机制。我们将回顾现有文献中关于GMEVs在ND中的作用，并重点分析动物模型和人类研究的实验结果。此外，我们将探讨与神经退行性疾病相关的多种机制，如神经炎症、OS、线粒体功能障碍、蛋白质错误折叠和聚集，以及其他致病过程。最后，我们将讨论这些GMEVs及其载荷的最新研究进展，这些研究有望为未来药物治疗的递送提供价值，并强调在这一不断发展的领域中的未来研究方向。

肠道微生物和细胞外囊泡概述

人类消化道中的微生物群集合通常被称为肠道微生物（GM）。先前的研究突出显示了GM的惊人多样性，其中包括超过100万亿个细胞，主要由细菌、真菌、古生菌和病毒组成。GM承担了广泛的功能，包括促进营养吸收和能量提取。此外，它还提供独特的代谢途径和代谢产物，这些对身体的正常运作至关重要。GM还作为一种天然的防御系统，促进自然免疫和获得性免疫的生长，并阻止可能破坏其微妙平衡的有害生物体的进入。除了代谢和防御作用外，微生物群还直接影响胃肠道的组成。它控制肠道细胞的功能、这些细胞之间的连接以及黏液的产生，从而维持胃肠系统的整体健康和平衡。

肠道微生物的失衡，通常被称为“菌群失调”，指的是肠道菌群组成和活动的紊乱或不平衡。这种紊乱表现为微生物多样性、丰度和代谢活动的变化。菌群失调已被证明与多种健康问题有关，特别是免疫失调和严重的炎症反应，如炎症性肠病、代谢综合征、心血管疾病和神经精神疾病。

肠道微生物细胞外囊泡

科学的最新进展通过揭示由肠道微生物细胞外囊泡（GMEVs）介导的复杂交互网络，扩展了我们对肠道菌群的理解。GMEVs，例如细胞外囊泡和外膜囊泡（OMVs），作为细胞间通信工具，使肠道细菌和宿主细胞之间的化合物和遗传物质能够进行交流和交换。这一双向通信系统参与了多种生理活动，如免疫调节、代谢调控和神经行为功能。

最近的数据显示，由菌群失调引起的GMEVs变化与神经退行性疾病的发生有显著关联。由于菌群失调，细胞外囊泡内容物的变化，例如microRNA（miRNAs）、脂质和蛋白质，可能会影响神经炎症、血脑屏障（BBB）的完整性及神经元的健康。此外，GM产生并通过GMEVs传递的化合物可能会影响神经退行性病变路径，特别是与蛋白质错误折叠和聚集有关的路径，这些路径与阿尔茨海默病和帕金森病等疾病相关。

肠-脑轴（GBA）是一种双向网络，连接肠道正常菌群、GMEVs和中枢神经系统（CNS），在调节正常和异常生物过程（如神经退行性疾病）中起着至关重要的作用。GM由多种微生物群落组成，通过许多过程与宿主相互作用，如生物活性化合物和GMEVs的产生。这些GMEVs携带miRNAs、蛋白质及其他生物活性物质，作为中介，促进GM与CNS之间的通信。另一方面，CNS可以通过自主神经系统和神经内分泌途径改变GM的组成和功能，从而影响微生物的繁殖、代谢及GMEVs的释放。NDs的一个显著特征是CNS信号的变化，这可能损害这一双向连接，进而加剧失衡和神经炎症。图1显示了肠道和大脑之间的双向通信。

细胞外囊泡（EVs）作为跨不同生物界（例如肠道微生物与哺乳动物）之间通信的重要介质，正越来越受到重视。EVs由真核生物、细菌和古生菌等所有生命领域产生，这些颗粒能够在同一细胞（自分泌）内或在邻近细胞（旁分泌）之间影响细胞功能。细胞通信通过EVs的释放而发生，EVs是被膜包裹的颗粒。由于携带的生物活性货物，GMEVs能够调节生物活动并影响生理过程。其货物包括蛋白质、脂质、核酸及小分子（代谢物）。

最早在1960年代，Escherichia coli（大肠杆菌）中记录了细胞外囊泡（BEVs）的存在。在2017年，Bryant, W.A. 提出GMEVs可能在胃肠道的扩散中起作用。

哺乳动物将EVs主要分为细胞外囊泡、微囊泡和凋亡小体，依据其生物合成和尺寸进行分类。细胞外囊泡是通过内吞作用产生的EV，尺寸范围为30-150纳米。相比之下，微囊泡直径在100-1000纳米范围内，由质膜产生。而凋亡小体则来源于经历凋亡过程的细胞，尺寸在50到5000纳米之间。植物也能够释放细胞外囊泡，其生物合成、内容和外观与哺乳动物的细胞外囊泡类似，这些植物细胞外囊泡有时被称为“类细胞外囊泡纳米囊泡”。根据Cuesta等人的研究，GMEVs与真核生物的EVs类似。它们的相似性包括10-400纳米的尺寸范围、球形形状以及理化特性，如冷冻时或在37°C下的稳定性。然而，也存在若干区别，如结构、耐高温性、成分及其来源。一个显著的相似点是，真核生物和GMEVs都能携带遗传物质，特别是miRNAs或类似miRNA的分子。这些分子已在多种类型的EV中检测到，包括哺乳动物的细胞外囊泡、微囊泡、凋亡小体、植物类细胞外囊泡纳米囊泡和细菌EVs。图2A展示了不同尺寸的EVs。

细菌外囊泡的生物生成

细胞外囊泡（BEVs）是具有重要生物学功能的膜包裹结构。与真核生物相比，BEVs在形成过程、内容物和尺寸等方面表现出独特的特征。革兰氏阴性菌以其产生外膜囊泡（OMVs）的能力而闻名，而革兰氏阳性菌则采用不同的、尚未完全理解的机制来产生EVs。革兰氏阴性菌不仅会产生OMVs，还会生成外-内膜囊泡及爆裂性OMVs，这些囊泡具有不同的生物生成途径和货物特性。

1990年，研究发现革兰氏阳性菌也能够产生EVs，这推翻了人们长期以来认为它们坚固的肽聚糖结构阻止囊泡生成的观念。革兰氏阳性菌的EVs不含脂多糖（LPS），但含有肽聚糖和蛋白质。尽管GMEVs的释放机制仍不完全清楚，但膨胀压力可能推动GMEVs通过细胞壁孔隙，而相关酶可能会降解肽聚糖屏障。研究发现，金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的GMEVs中含有降解肽聚糖的酶，这支持了后者的观点。Toyofuku等人发现，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）菌株中由噬菌体编码的内溶素酶通过水解肽聚糖来促进GMEVs的生物生成。此外，S. aureus的酶，如酚可溶性调节因子和自溶素，也有助于GMEVs的产生。图2B-F展示了GMEVs的生物生成及其过程。

图1. 肠道与大脑通过肠道微生物细胞外囊泡进行通信

 (A) 这些纳米囊泡穿过我们的肠壁，进入血液循环。随后，它们可能穿越至大脑并影响大脑细胞。(B) 它们还通过迷走神经作为运输手段到达大脑。

GMEVs作为多功能载体，可以携带多种生物分子，包括蛋白质、核酸、小分子和脂质。这些货物被精心封装在GMEV的膜内，从而实现对目标细胞的递送。

GMEVs及其蛋白质货物

肠道微生物的GMEVs含有许多蛋白质，这些蛋白质在宿主-微生物相互作用中起着重要作用。这些蛋白质对宿主的生理和免疫反应至关重要。革兰氏阳性菌释放含有膜蛋白和细胞质蛋白的GMEVs，这些蛋白质在多种细胞功能中发挥作用。致病菌株通过GMEVs携带致病性物质。革兰氏阴性菌产生的GMEVs富含周质和外膜蛋白。这些蛋白质在细菌的生长、定植、持续存在及逃避宿主免疫系统方面起着关键作用。GMEVs中的蛋白质可以调节树突状细胞的成熟及细胞因子的产生，进而影响免疫反应。

GMEVs及其核酸货物

GMEVs包含DNA、RNA以及短链非编码RNA。这些囊泡对细菌的遗传交换至关重要，并能影响宿主基因表达及免疫反应。微生物源性细胞外RNA（exRNA）会影响上皮细胞和免疫细胞的炎性细胞因子产生。微生物exRNA还可能像真核生物长非编码RNA一样，调控表观遗传。新的研究发现，GMEVs携带的遗传物质可能会影响神经退行性疾病的发生。这些囊泡中的核酸突显了囊泡介导的递送系统的有效性。与易于降解的游离核酸不同，GMEVs保护其货物，使其能够成功穿越生理屏障。因此，GMEVs中携带的RNA展示了囊泡介导的递送机制的强大功能，强调其在穿越生理屏障时保护和传递生物活性物质的有效性。

图2. 肠道微生物细胞外囊泡及其生物生成

全面描绘了 (A) 不同尺寸范围的细胞外囊泡，(B, C) 细菌结构，(D, E) 其生物生成过程，(F) 外膜囊泡的各种分类，以及 (G) 它们的货物。革兰氏阴性菌的肠道微生物细胞外囊泡（GMEVs）通过膨出过程（当外膜形成小突起）或在细胞爆裂性裂解期间产生。典型外膜囊泡（OMVs）的形成是由于疏水性分子的突起或肽聚糖生成的不稳定性，导致外膜膨出。肽聚糖层的薄弱会导致内膜膨出，形成爆裂性外膜囊泡或外-内膜囊泡。革兰氏阳性菌的 GMEVs 通过称为细胞冒泡死亡的过程产生。在此过程中，一种名为内溶素的酶会分解肽聚糖层，导致细胞裂解并产生细胞膜囊泡。EV，细胞外囊泡。

GMEVs及其小分子货物（代谢物等）

肠道微生物在多种代谢物的合成中起着关键作用，这些代谢物是影响宿主生理和健康的重要小分子。微生物代谢物作为信号分子，促进肠道微生物与宿主之间的通信，影响诸如代谢、免疫功能和心理健康等多种生物过程。GMEVs的代谢物组分包括由微生物代谢生成的多种小分子，如短链脂肪酸、胆汁酸、神经递质及次级代谢产物。研究发现，肠道菌群可以合成如多巴胺、去甲肾上腺素和γ-氨基丁酸（GABA）等神经递质。代谢组学技术的进步使得代谢物的全面分析成为可能，帮助我们深入理解这些代谢物在宿主与微生物相互作用中的关键作用。与GMEVs相关的代谢物已被证明会影响宿主生理及疾病易感性。GM产生的短链脂肪酸在调节宿主免疫反应和炎症信号通路中起着重要作用，从而维持肠道稳态。因此，理解GMEVs中代谢物的结构及其重要性对于揭示肠道微生物与宿主相互作用的复杂机制，以及对人类健康的影响至关重要。

GMEVs及其脂质货物

脂质作为革兰氏阴性菌外膜囊泡（OMVs）的结构成分，起着至关重要的作用。OMVs中的脂质与细菌外膜中的脂质相似。然而，某些独特脂质仅存在于OMVs中。研究发现，致病性大肠杆菌的OMVs主要含有甘油磷脂、磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺及心磷脂，这些脂质有助于维持OMVs的球形结构。此外，研究还表明，来自丁香假单胞菌（P. syringae）的OMVs主要含有磷脂酰甘油和磷脂酰乙醇胺。

革兰氏阴性菌外膜中的脂多糖（LPS）的二酰基A脂质成分也存在于OMVs中。研究发现，铜绿假单胞菌的OMVs含有较高浓度的带负电荷的B型LPS，而不是中性的A型LPS，这可能是由于外膜中相邻B型分子之间的排斥力。相比之下，牙周致病菌齿状普氏菌（Porphyromonas gingivalis）的OMVs则富含A型LPS。此外，OMVs中的磷脂成分还会影响囊泡膜的柔韧性和刚性。例如，P. gingivalis的OMVs中含有具有长糖链的LPS分子和二酰基脂质A。

革兰氏阳性菌细胞膜囊泡的脂质组成因细菌种类而异，这可能表明它们在不同环境中的适应能力。炭疽芽孢杆菌（Bacillus anthracis）和肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）的囊泡中含有大量碳链长度为C12到C16的饱和脂肪酸。相反，单核李斯特菌（Listeria monocytogenes）的GMEVs中含有较高比例的含有不饱和脂肪酸的脂质，与其细菌细胞相比。图2G展示了GMEVs及其分子货物。

GMEVs对神经退行性疾病的影响

神经退行性疾病（NDs）是一组以神经细胞逐渐退化为特征的疾病，对全球人口构成了重大且日益增长的威胁。尽管多年来进行了广泛研究，目前对NDs仍缺乏有效的治疗方法，且尚未有确立的疗法能够阻止或减缓这些疾病的进展。这突显了开发新型治疗方法的重要性。最新研究表明，肠-脑轴（GBA）的双向通信网络，即肠道微生物与中枢神经系统（CNS）之间的联系，在ND的发病中起作用。特别是，GMEVs被认为是促进这种信号传递的潜在介质，影响神经炎症过程、蛋白质聚集及神经元功能障碍。

研究表明，GMEVs能够调控大脑的基因表达，并在神经炎症和神经退行性阶段造成病变。因此，它们被认为是阿尔茨海默病（AD）、帕金森病（PD）等多种疾病的促成因素。GMEVs的致病与治疗作用列在表1中。

GMEVs对阿尔茨海默病的影响

阿尔茨海默病（AD）是一种以淀粉样蛋白斑块积聚、神经原纤维缠结及神经炎症为特征的主要记忆障碍。越来越多的证据表明，GMEVs可能促进AD的发展。研究显示，动物模型及人类AD患者的EVs内容发生了变化，如淀粉样β肽、炎性细胞因子和miRNAs。肠道失调可能在AD的发展中起作用，可能通过引发大脑炎症、破坏血脑屏障（BBB）的保护作用及促进淀粉样蛋白病理的传播。研究表明，GMEVs能够在AD动物模型中引发神经炎症并削弱突触功能。

最新研究表明，GMEVs会损害神经元，导致神经炎症，并影响小胶质细胞的功能。Teng等人发现，正常菌群代谢物异戊胺（isoamyl amine）会引起小胶质细胞损伤，加剧与年龄相关的认知能力下降。此外，研究表明，GMEVs可能会破坏BBB，允许有害物质和病原体进入大脑。

GMEVs对帕金森病的影响

表1. 肠道微生物细胞外囊泡的致病与治疗作用

GMEVs在神经退行性疾病中的潜在机制

研究GMEVs对神经退行性疾病（NDs）的影响机制是一个迅速发展的研究领域，对基础科学知识和医学治疗都有重要意义。最新研究表明，GMEVs在胃肠道（GI）与大脑之间的联系中扮演多重角色，并可能参与阿尔茨海默病（AD）、帕金森病（PD）等NDs的发病。然而，GMEVs进入大脑的机制尚未完全理解。本节探讨GMEVs可能通过哪些途径对大脑造成损害，进而导致NDs的发生。现有的体内和体外研究表明，GMEVs对NDs的影响可能涉及多种机制。

GMEVs与NDs中的神经炎症和氧化应激的联系

神经炎症是多种NDs发展中相关的过程，对NDs的启动和进展有显著影响，如AD和PD等。神经炎症可能由多种因素触发，包括创伤、感染、氧化剂、氧化铁、Tau寡聚体及淀粉样β蛋白（Aβ）等，这些因素引发促炎性细胞因子的异常释放。另一方面，氧化应激（OS）是指活性氧（ROS）合成与生物系统清除反应中间产物或修复损害能力之间的不平衡。NDs中的ROS过量会损害细胞，尤其是那些具有快速氧气需求和抗氧化能力不足的神经元。OS引发脂质过氧化、蛋白质氧化及DNA损伤，这在NDs的发展中起着重要作用。

根据Cuesta等人的研究，GMEVs通过调节免疫反应对脑功能障碍具有重要影响。研究发现，携带ROS的EVs会通过改变信号通路并激活炎性小体，可能导致NDs的发生。Ullah及其同事的研究显示，GM来源的EVs（代谢物）可能会影响中枢神经系统（CNS）的OS，进而影响NDs的进展，包括PD和AD。此外，Wang等人提出，肠道健康与脑部疾病之间存在关联，认为GM的紊乱可能会增加OS并破坏氧化还原稳态，从而促成NDs的发生。

此外，许多研究表明，AD患者的粪便中存在更高水平的钙卫蛋白，标志着肠道菌群失调状态。大量肠道细菌菌株能够通过产生神经递质来调节神经系统功能。某些细菌类群（特别是双歧杆菌）的减少会影响乙酰胆碱（Ach）及其他神经递质的合成，这提示肠道失调、神经递质失调和OS之间可能存在外周-中枢关联。

因此，GMEVs显著影响NDs中的OS，为疾病管理和神经保护提供了潜在的治疗机会。

神经炎症和OS之间的关系错综复杂。当OS激活核因子-κB（NF-κB）时，会产生炎性细胞因子，而NF-κB是炎症过程中的一个关键转录因子。许多NDs与氧化还原酶（NADPH氧化酶，NOX）的增加有关，这类酶家族作为代谢副产物生成ROS。NOX还参与神经炎症和OS。

GMEVs与CNS中的免疫细胞、星形胶质细胞及小胶质细胞的激活有关，它们通过递送生物活性物质（如LPS、脂蛋白和miRNAs）发挥作用。这些EV相关的分子能够结合小胶质细胞和星形胶质细胞表面的模式识别受体，启动细胞内通信级联反应，最终导致炎性细胞因子的释放。LPS是存在于革兰氏阴性菌外膜中的高活性分子，可以强烈激活小胶质细胞和星形胶质细胞。当TLR4（Toll样受体4）检测到LPS时，小胶质细胞和星形胶质细胞发生表型转化，包括形态变化和促炎性细胞因子（如TNF-α、IL-1β和IL-6）的释放。这些细胞因子会吸引和激活CNS外的免疫细胞，进而在大脑中扩散炎症。

此外，Han等人的研究表明，当将Aggregatibacter actinomycetemcomitans的GMEVs通过心脏内注射到小鼠体内时，它们成功跨越BBB并将GMEVs中的exRNA转移至宿主巨噬细胞。TLR8的激活及随后的NF-κB信号通路启动了短RNA通过外膜囊泡分泌引起的TNF-α的产生。GMEVs被证明会上调TNF-α表达，这被认为与神经炎症疾病如AD的发生有关。另一项研究表明，牙周致病菌A. actinomycetemcomitans释放的GMEVs可以通过将exRNAs递送至单核细胞和小胶质细胞，激活NF-κB，并导致脑中IL-6水平增加。

此外，GMEVs还可能携带能够与细胞表面受体（如TLR2和CD14）相互作用的脂蛋白，从而刺激小胶质细胞和星形胶质细胞。脂蛋白的检测会激活炎性信号通路，导致化学因子和细胞因子的产生，进而促进神经炎症。

近年来的研究还突出了GMEVs衍生的miRNAs在调节CNS中的神经炎症反应中的作用。GMEVs相关的miRNAs可以被小胶质细胞和星形胶质细胞吸收，在那里调节与炎性信号通路相关的目标基因表达。此外，微生物代谢物（如色氨酸、丁酸、乙酰胆碱、去甲肾上腺素、5-羟色胺及多巴胺）可以通过调节星形胶质细胞功能及维持BBB完整性间接影响miRNA生物学。这些代谢物还可能通过干扰正常的神经递质水平影响人类行为。

因此，目前的研究结果表明，GMEVs通过递送LPS、脂蛋白和miRNAs等生物活性物质，显著影响CNS中的神经炎症。小胶质细胞和星形胶质细胞的激活及促炎性细胞因子和化学因子的增加导致神经元损伤，加剧NDs。

图3. 肠道微生物细胞外囊泡对神经退行性疾病的攻击机制

本图展示了肠道微生物与大脑健康之间复杂的关系。不健康的肠道微生物会释放外膜囊泡（OMVs），导致胃肠道炎症和肠道菌群失调。这会破坏血脑屏障（BBB），引起全身性炎症和神经炎症。该级联反应包括上皮屏障的削弱、自主神经系统与大脑的连接以及中枢神经系统免疫细胞的入侵。肠道的炎症反应涉及肠道黏膜下的肠神经、免疫细胞和树突状细胞。它们可以感知胃肠道的变化，并通过自主神经系统向大脑发送信号。OMVs 也可以穿过 BBB，激活小胶质细胞，产生促炎细胞因子，从而影响大脑功能并加重神经炎症。注意：↑ = 增加，↓ = 减少。

GMEVs与神经退行性疾病中的蛋白质错误折叠

蛋白质错误折叠和随后的蛋白质聚集是神经退行性疾病（NDs）的标志性特征之一，例如阿尔茨海默病（AD）、帕金森病（PD）和亨廷顿病（HD）。在这些疾病中，异常折叠的蛋白质会形成不溶性纤维状聚集体或包涵体，最终引起神经细胞损伤及功能障碍。例如，AD中出现淀粉样β蛋白（Aβ）和Tau蛋白的聚集，而PD则表现为α-突触核蛋白（αSyn）的错误折叠和累积。越来越多的证据表明，GMEVs在这些异常蛋白质的传播和积累中发挥作用。

研究表明，肠道微生物细胞外囊泡（GMEVs）能够携带错误折叠的蛋白质及与聚集相关的分子，并可能在大脑内外促进其扩散。例如，Han等人的研究发现，Aggregatibacter actinomycetemcomitans释放的GMEVs中含有内源性小RNA，这些小RNA通过激活炎性通路（如NF-κB信号）诱导神经炎症和神经毒性。此外，发现特定细菌可以分泌影响宿主细胞内蛋白质折叠过程的酶或小分子化合物，这可能会引发与NDs相关的错误折叠蛋白质的累积。

有趣的是，研究表明，GMEVs能够跨越血脑屏障（BBB），这是传播病理性蛋白质的潜在机制。细胞外囊泡能够携带诱导神经退行性疾病的特定分子，并在大脑中触发病理级联反应。这些细胞外囊泡载荷包括细菌LPS、毒素、蛋白质及非编码RNA（如miRNAs），这些分子可以直接影响中枢神经系统（CNS）内的蛋白质代谢。研究还发现，GMEVs可以促进蛋白质错误折叠和聚集，可能通过直接影响神经元内的分子伴侣功能或改变蛋白质降解路径来实现。

此外，淀粉样蛋白聚集的逐步积累及其对细胞功能的有害影响，已在ND模型中被广泛研究。在PD的案例中，研究者发现GMEVs可能作为αSyn聚集的载体，将这些错误折叠的蛋白质从肠道传播至大脑。在小鼠模型中，摄入由致病细菌产生的GMEVs会导致αSyn在大脑中的积累，并伴随运动行为的损害。这一发现进一步支持了肠道微生物-脑轴与NDs发病机制的关系。

除了直接传播错误折叠的蛋白质，GMEVs还可以通过调节宿主的基因表达来影响蛋白质聚集。例如，GMEVs携带的非编码RNA，如microRNA，可以靶向与蛋白质折叠相关的基因，改变其表达并促进异常蛋白质的累积。此外，GMEVs载荷中的蛋白质修饰酶，如磷酸化酶和去乙酰化酶，可能会干扰神经元内的蛋白质稳定性和降解途径，从而增加错误折叠蛋白质的积累。

综上所述，GMEVs在NDs中通过多种机制促进蛋白质错误折叠和聚集。这些机制包括直接携带错误折叠的蛋白质、改变神经元内的蛋白质代谢及通过非编码RNA干扰基因表达。随着我们对GMEVs的致病潜力的认识逐渐加深，进一步的研究将为开发新的治疗策略提供方向，这些策略可能通过靶向GMEVs或其携带的货物来预防或减轻蛋白质错误折叠病理。

GMEVs与神经退行性疾病中的线粒体功能障碍

线粒体在大脑网络的发育和维持中发挥至关重要的作用，负责能量生成、促进细胞间的通信，并调控被称为细胞凋亡的程序性细胞死亡。线粒体功能障碍是神经退行性疾病（NDs）的特征性表现之一。研究表明，肠道微生物细胞外囊泡（GMEVs）可以通过多种机制影响线粒体功能，例如控制线粒体的生成、运动和降解（即线粒体自噬）。Deo等人在一项最新研究中发现，来自大肠杆菌（E. coli）的GMEVs会导致线粒体功能障碍、线粒体死亡，并在帕金森病（PD）中引发炎症。

Esteves等人通过小鼠模型和细胞培养实验验证了一个假设，即肠道微生物产生的有害化合物会增加PD中的神经炎症。他们发现，肠道微生物产生的β-N-甲基氨基-L-丙氨酸通过降低肠道通透性进入大脑并穿过血脑屏障（BBB）。该化合物导致神经元损伤，尤其是由于线粒体功能衰竭引起的。因此，这些数据表明，GMEVs在导致线粒体功能障碍和神经炎症中起重要作用，而这被认为与NDs的发展有关。

研究表明，GMEVs携带的信号分子包括miRNAs和蛋白质，这些分子能够直接与线粒体通路相互作用。已知GMEVs具有独特的miRNAs，这些miRNAs可以调控与能量代谢和细胞凋亡相关的线粒体基因。调节这些miRNAs的失衡可能导致线粒体功能受损，进而促进神经退行性过程的发生。GMEVs还可能携带与线粒体动力学相关的蛋白质，包括那些调节线粒体分裂和融合的蛋白质。线粒体的完整性和功能依赖于这些动力学，而它们的紊乱与NDs的发展密切相关。

GMEVs与神经退行性疾病中血脑屏障（BBB）功能障碍的关联

血脑屏障（BBB）在控制分子在循环系统和脑实质之间的转运方面起着至关重要的作用，这对于大脑的代谢过程和神经元功能是必要的。因此，保护BBB的功能和结构完整性对于维持大脑微环境的平衡和稳定至关重要。多种神经退行性疾病（NDs）都伴随着BBB的破坏，导致神经炎症、神经元功能障碍和神经退行性变。研究显示，肠道微生物细胞外囊泡（GMEVs）在影响BBB的完整性和功能方面起着重要作用。研究已表明，GMEVs可以穿越这一屏障，并通过炎症或感染机制增加其通透性。

有研究表明，在已故阿尔茨海默病（AD）患者的大脑中存在细菌核酸。这些遗传物质可能是通过利用AD患者受损的BBB进入GMEVs中。这可能导致GMEVs或病原体，如细菌，穿越BBB并在大脑中定植。最新研究表明，GMEVs可以直接穿透BBB。多项研究已经证明，含有脂多糖（LPS）的GMEVs可能通过诱导内皮细胞死亡和破坏紧密连接蛋白，促进血管通透性增加和BBB的失效。当肠道屏障和BBB受损时，LPS可能会进入血液和大脑。这会激活小胶质细胞上的TLR4受体，加剧淀粉样蛋白的聚集，并加速NDs的发展。

这些研究结果明确表明，GMEVs在削弱BBB的完整性并促进NDs的进展中起着重要作用。上述路径如图4所示。

实验方法与技术

为了更深入地了解GMEVs与神经退行性疾病（NDs）之间的关系，开发灵敏、准确和标准化的生物检测方法以确定临床样本中EVs的组成和分子特征至关重要。这对于EVs的快速临床应用非常重要。由于EVs具有独特的尺寸特性——比细胞小但比蛋白质大——因此它们与传统的分析目标明显不同。分离技术对于获得适合下游分析的纯GMEVs至关重要。

超速离心法是一种成熟的技术，使用一系列不同速度的离心步骤，根据GMEVs的大小和密度进行分离。类似地，密度梯度超速离心和尺寸排阻色谱提供了分离GMEVs的替代方法，能确保较高的纯度并保持GMEVs的完整性。最近，Wei等人引入了一种新方法，使用抗菌物质ε-聚-L-赖氨酸（ϵ-PL）来分离GMEVs。此方法允许在较低的离心速度（10,000g）下沉淀GMEVs，为标准超速离心法提供了一种替代方案。

然而，尽管这些方法有效，但也存在一些局限性，如表2所示。进行这些实验通常耗时且需要专业设备。此外，还存在共分离非GMEVs污染物的风险，这可能会影响GMEVs制备的纯度。为克服这些局限性，科学家们正在研究基于微流体的新型分离方法，这些方法旨在提高分离过程的效率和纯度。

一旦分离出GMEVs，分析其货物成分就变得至关重要，以深入了解其功能作用。蛋白质组学、RNA测序和脂质组学经常用于分析EVs的货物成分。通过基于质谱的蛋白质组学，科学家对EVs中的蛋白质有了全面的了解，为这些蛋白质在NDs中的作用提供了宝贵见解。RNA测序可发现与EVs相关的RNA种类，如mRNA和miRNA，提供其调控作用的重要信息。此外，脂质分析技术揭示了EVs膜的脂质组成及其在信号通路中的作用。

尽管货物分析提供了大量信息，但组学方法仍然存在一些挑战。由于技术变异性和特定货物分子可能稀少，这些任务需要专业技能。因此，必须使用不同方法验证研究结果，并整合多种组学方法以确保结果的可靠性。

功能分析可以进一步加深对GMEVs货物生物影响的理解。利用神经元或胶质细胞系的细胞培养模型，研究人员能够研究EVs对与神经退行性变相关的细胞过程的影响。动物模型则提供了在体内条件下的宝贵见解，能够评估EVs对疾病进展和神经病理的影响。通过生化分析，科学家可以测量GMEVs货物分子的特定活性或相互作用，从而更好地理解GMEVs货物的功能意义。

然而，由于GMEVs的多样性及NDs的复杂性，解析功能分析的结果可能非常棘手。结合不同的方法，如类器官培养或共培养系统，可以提高研究结果的准确性和适用性。最终，结合多种技术和分析方法的综合研究方法对于理解GMEVs对NDs的影响至关重要。技术的进步、协议的标准化以及研究结果的验证将推动该领域的发展，从而更深入地理解疾病机制并开发潜在的治疗干预措施。

图4. 肠道微生物细胞外囊泡在神经退行性疾病中的潜在作用路径

(A) 氧化应激和神经炎症，(B) 血脑屏障破坏，(C) 蛋白质错误折叠与聚集，(D) 线粒体功能障碍。注意：↑ 表示增加，↓ 表示减少。

表2. 隔离方法的有效性和局限性

GMEVs的治疗前景与实际应用

对GMEVs在神经退行性疾病（NDs）中作用的研究为临床应用带来了令人兴奋的潜力。这些由肠道微生物（GM）产生的纳米囊泡在肠-脑连接中的潜在作用引起了广泛关注，影响神经功能及疾病的进展。

GMEVs作为诊断生物标志物

GMEVs作为治疗剂

此外，GMEVs在追求创新治疗方法方面展现了令人瞩目的未来潜力，吸引了广泛关注。研究发现，GMEVs可以作为潜在的治疗靶点，通过调整肠道微生物（GM）的组成来缓解神经退行性过程。在阿尔茨海默病（AD）的动物模型中，来自特定GM菌株（如双歧杆菌）的GMEVs对免疫系统有显著影响。使用这些GMEVs后，大脑炎症显著减少，同时整体大脑功能显著改善。这些有趣的发现表明，GMEVs对神经元具有显著的保护作用。

此外，研究还发现GMEVs在其他应用中具有前景，例如来自粘蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphila）的GMEVs。在帕金森病（PD）的小鼠模型中，这些GMEVs表现出显著降低神经炎症的能力。这种效果归因于它们能够降低大脑中的促炎性细胞因子水平，并增加抗炎性细胞因子的含量。这些研究结果强调了GMEVs在调节NDs中的免疫反应方面的能力，表明这是一个具有潜力的研究领域，并指出GMEVs作为治疗这些致残疾病的有效方法的可能性。

GMEVs作为药物递送系统

同时，转化研究和正在进行的临床研究正积极探索使用GMEVs进行疾病治疗。在这些研究领域中，重要的一项是推进基于细胞外囊泡的药物递送系统的发展。研究人员希望利用细胞外囊泡的天然特性来开发能够靶向特定脑区或递送治疗性化合物（如神经保护药物或基因治疗）的细胞外囊泡。血脑屏障（BBB）通常是药物递送到大脑的主要障碍，而GMEVs有能力克服这一生物屏障并传递有效载荷。

在模型生物中，使用细菌细胞外囊泡（BEVs）作为药物递送载体已显示出令人鼓舞的效果。在这种背景下，GMEVs被用于将治疗性物质，如小干扰RNA（siRNA）和药物，递送到特定的脑细胞。例如，来源于间充质干细胞的细胞外囊泡递送活性siRNA靶向Tau蛋白，结果在阿尔茨海默病（AD）的小鼠模型中，Tau蛋白的磷酸化和聚集被显著减少。

在一项最新研究中，Chen等人进行了结合纳米金和GMEVs的实验，以提高对胶质母细胞瘤的放疗和免疫疗法的效果。结果显示了令人鼓舞的结果，包括小鼠的生存期显著延长。此外，GMEVs有潜力被附近的中性粒细胞内化，并激活小胶质细胞的反应。这表明GMEVs可以作为药物递送的工具，专门递送药物到小胶质细胞。

GMEVs还能够携带药物及其相关酶，这使得它们可以与宿主上皮细胞进行交互并穿透这些细胞。由于其穿越BBB的能力，GMEVs显示出了巨大的前景。这使它们成为药物递送系统的有力候选者，因为它们能够克服生物屏障并高效递送治疗性物质。

GMEVs作为治疗性疫苗

如上所述，肠道菌群失调是神经退行性疾病（NDs）的主要原因。因此，使用GMEVs作为治疗性疫苗是一种有效的策略。这些疫苗并非直接攻击病原体，而是防止感染性因子产生有害化学物质，从而帮助预防可能导致疾病的微生物改变。例如，一种针对常见微生物糖类的疫苗引发了强大的免疫反应，该疫苗源自大肠杆菌Nissle 1917（EcN）的GMEVs。与通常昂贵且费时的传统疫苗相比，这种疫苗效果更好。GMEVs的治疗应用如图5所示。

GMEVs的优缺点

GMEVs 提供了许多健康和疾病管理的益处。这些囊泡能够影响宿主的免疫反应，以增加耐受性或减少炎症反应。由于其独特的组成和生物相容性，GMEVs 在药物递送方面具有优势。作为疫苗候选者，GMEVs 具有提高免疫反应和抗原呈递的潜力。它们还可以辅助疾病的识别，因为其负载物可能揭示宿主的病理状况。研究和利用 GMEVs 虽有一定优势，但也存在一些重要的缺点。主要是与细胞外囊泡的特征化相比，GMEVs 的特征化尚处于早期阶段，这是由于肠道细菌群体的复杂性和多样性。

为了达到一致性和可重复性，还需要进一步优化 GMEVs 的分离和纯化过程。此外，GMEVs 在不同病原情况下的作用尚不清楚，这需要进一步研究以填补这一信息空白。不同细菌种类或菌株可能改变 GMEVs 的组成和功能，这进一步增加了研究结果的复杂性。必须克服这些障碍，以确保 GMEVs 在生物医学研究中的有效应用，并将其充分利用于临床治疗。我们在表 3 中提供了 GMEVs 的优缺点。

GMEVs 为神经系统疾病提供了一个充满希望的解决方案，能够递送多种有益物质，如脂质、小分子和 miRNAs。通过这些物质的释放，GMEVs 产生了复杂的影响，协调多种机制以改善神经健康。GMEVs 支持神经元功能，平衡小胶质细胞活动，促进血脑屏障（BBB）完整性，减少炎症和氧化应激（OS），并稳定肠道完整性。这一综合努力强调了 GMEVs 可能成为神经系统疾病的可行治疗方法。

图5. GMEV 的治疗应用

肠道菌群细胞外囊泡可以对肠脑轴的不同方面产生积极影响，从而改善大脑健康。平衡肠道微生物，改善血脑屏障完整性，减少神经炎症，最终阻碍神经退化。注：↑ 表示增加，↓ 表示减少。GMEV，肠道菌群细胞外囊泡。

GMEVs 在神经疾病病因中具有多种作用，影响氧化应激（OS）、神经炎症、线粒体功能障碍以及其他细胞过程。要开发通过靶向肠脑轴（GBA）来治疗神经疾病的新方法，至关重要的是理解这些效应背后的机制及其具体的货物分子。近年来，对 GMEVs 在神经疾病中的作用的研究引起了大量关注。

一方面，有一个关于 GMEVs 在神经疾病发展中潜在作用的引人入胜的叙述。GMEVs 是一种具有重要作用的囊泡。由于其惊人的能力，可以影响包括神经炎症、氧化应激、蛋白聚集和线粒体功能障碍在内的多种过程，以及穿越血脑屏障（BBB）到达大脑的能力，它们可能在神经疾病的发展中起重要作用。另一方面，GMEVs 也可能有朝一日作为神经疾病的治疗手段使用，因为它们具有独特的特性。它们显著影响免疫反应和穿越生物屏障的能力使其在各种治疗环境中特别适合于靶向药物递送和免疫调节。GMEVs 穿越 BBB 并引发对抗原的防御机制的能力是一个重要成果，可能导致它们在多种神经系统疾病治疗中的应用。

未来的疫苗开发中，来源于益生菌的 GMEVs 带来了希望，它们能够引发强大的免疫系统反应。它们完成这一目标的能力展示了其在促进靶向药物递送到大脑、恢复微生物群健康平衡以及增强免疫系统对消化道病原菌的防御方面的潜力。GMEVs 疫苗接种可以缓解神经炎症并防止神经疾病的发生。此外，它们还可以帮助我们更好地了解神经疾病的成因，从而开发出新的治疗方法。

在研究和选择用于神经疾病的 GMEVs 时必须考虑若干因素。由于 GMEVs 分离和表征方法的不同，获得的数据往往存在差异，这是一项主要难题。由于使用的方法缺乏标准化，导致结果不一致，因此难以在不同研究之间进行有意义的比较。

为了全面理解益生菌与神经系统疾病之间的复杂关系，需要进行更多研究。目前的证据中，GMEVs 影响神经保护和认知表现的具体方式仍不清楚。因此，迫切需要精心设计的临床试验来评估其对不同年龄群体的影响。这些试验应采用标准化的提取和表征技术，并包括多样化的人群。

超滤、密度梯度离心法和尺寸排阻色谱法是最近用于从人体体液中分离 GMEVs 的三种方法。另一个挑战是，目前缺乏可靠的方法来确定 GMEVs 的母体细菌来源，或它们在多样且异质的微生物群（如肠道菌群）中的含量。未来的研究需要展示 GMEVs 内容物和生产的可变性与母体微生物组可变性之间的联系。此外，还需要进一步研究 GMEVs 包装的以下方面：

●  分子包装的原因。

●  特定细胞的靶向。

●  货物的释放方式。

●  GMEVs 穿越生物屏障，如血脑屏障和肠道屏障的能力。

表3. 细菌细胞外囊泡（BEV）的优点和主要困难

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“iMeta” 是由威立、肠菌分会和本领域数百千华人科学家合作出版的开放获取期刊，主编由中科院微生物所刘双江研究员和荷兰格罗宁根大学傅静远教授担任。目的是发表所有领域高影响力的研究、方法和综述，重点关注微生物组、生物信息、大数据和多组学等。目标是发表前10%(IF > 20)的高影响力论文。期刊特色包括视频投稿、可重复分析、图片打磨、青年编委、前3年免出版费、50万用户的社交媒体宣传等。2022年2月正式创刊发行！发行后相继被Google Scholar、SCIE、ESI、PubMed、DOAJ、Scopus等数据库收录！2024年6月获得首个影响因子23.8，位列全球SCI期刊前千分之五(107/21848)，微生物学科2/161，仅低于Nature Reviews，同学科研究类期刊全球第一，中国大陆11/514！

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