iMeta | 娄翼来/蒋瑀霁/李洪波-大气二氧化碳浓度升高下根际微食物网介导的作物磷获取策略

二氧化碳浓度升高条件下，作物通过改变根系性状和根际微食物网来挖掘磷营养以满足生长需求

●  二氧化碳浓度升高促进了小麦根长、有机酸阴离子、丛枝菌根真菌生物量和小麦磷的积累；

● 二氧化碳浓度升高降低了钙结合态无机磷和中等不稳定有机磷含量，但增加了根际有效磷的含量；

●  二氧化碳浓度升高促进了产碱性磷酸单酯酶细菌、原生动物以及食细菌和食真菌线虫的生长，并强化了它们之间的营养相互作用。

引  言

磷是植物和土壤生物群生长所必需的元素。尽管全磷在许多土壤中含量较高，但在碱性土壤中主要以钙结合态无机磷或有机磷的形式存在。在许多低投入的农业系统中，只有少量的有效态无机磷（正磷酸盐）能够被植物和微生物直接利用，这往往限制了作物的生产力。植物已经进化出几种获取磷的策略来满足它们的生长需求：（1）促进根系生长，扩大根系吸收面，直接吸收土壤有效磷；（2）加强与丛枝菌根真菌的共生，通过促进菌丝的生长，探索更大的土壤体积吸收有效态磷；（3）向根际释放更多的能够活化磷的分泌物（如有机酸阴离子），促进难溶性磷向有效磷的转化；（4）促进根际产解磷菌的生长，通过磷酸酶促进有机磷矿化。然而，在二氧化碳升高的情况下，植物如何调整或协调这些策略以增强磷的获取，仍然存在很多未知。

当土壤中有效磷足以满足植物需求时，二氧化碳浓度升高可以显著增加植物生物量。而长期二氧化碳升高下，作物收获带走的磷会导致土壤有效磷的耗竭，但难溶性无机磷的溶解和有机磷的矿化也可以补充有效磷库。此外，在二氧化碳浓度升高的作用下，植物可以增加对地下部的碳分配，促进根系生长和根系分泌物的渗出，从而增强土壤磷的动员，并为根际微生物群的生长和代谢活性提供有机基质，而微生物生物的生长对磷的固定会降低植物对有效磷利用。然而，随着微生物生物量磷的周转，磷的再矿化可能对补充速效磷，进而提高作物生产力。此外，二氧化碳浓度升高可以显著刺激根系中丛枝菌根真菌的定殖，并能调节丛枝菌根真菌的群落组成，提高磷捕获效率，从而促进植物生长。

目前，大多数研究都集中非生物参数和植物性状对产碱性磷酸单酯酶细菌和丛枝菌根真菌的生长和群落组成的影响上，但对原生动物和线虫通过在根际通过选择性捕食塑造微生物群落结构和养分循环中发挥关键作用关注较少。已有研究发现，食细菌和食真菌线虫和原生动物的捕食可以通过调节产碱性磷酸单酯酶细菌和丛枝菌根真菌的生物量、丰度以及组成来促进磷循环和植物生长。例如，Zheng等人发现线虫的选择性捕食促进了细菌关键分类群与相关成员的竞争，从而增强了产碱性磷酸单酯酶细菌的多样性，增加了油菜籽根际碱性磷酸酶的活性，从而提高了磷的有效性。Jiang等研究表明，食真菌线虫的选择性捕食增加了丛枝菌根真菌在作物根系中的定殖，从而提高了作物的磷积累量和生产力。综上所述，捕食者可以刺激微生物活动和磷矿化，从而促进磷的有效性、磷的获取和植物生长。迄今为止，对于不同的原生动物和线虫如何在环境变化条件下通过放牧有益微生物（如产碱性磷酸单酯酶细菌和丛枝菌根真菌）来促进磷循环和植物生长的生态机制的探索还很少，尤其是在二氧化碳升高的环境下。

在本研究中，通过15年的二氧化碳浓度升高试验（FACE）来评估在二氧化碳浓度升高条件下小麦磷获取和土壤磷组分的变化，并阐明小麦根际土壤微生物群（包括产碱性磷酸单酯酶细菌、丛枝菌根真菌、原生动物、食细菌和食真菌线虫）之间的联系。我们提出了以下三个科学问题：（1）二氧化碳浓度升高如何影响小麦生长、植株磷积累和根际磷组分？（2）在二氧化碳浓度升高条件下，植物是否以及如何协调根系形态生理性状、产碱性磷酸单酯酶细菌和丛枝菌根真菌的群落来捕获磷？（3）在不同的二氧化碳浓度环境下，原生动物和线虫与其潜在猎物（产碱性磷酸单酯酶细菌和丛枝菌根真菌群落）的相互作用模式和程度如何？我们假设二氧化碳浓度升高会强烈地塑造根性状、生长和根际微生物群的群落组成及其营养关系，增加根际无机和有机磷组分的动员和作物对磷的吸收。

结  果

与环境二氧化碳相比，二氧化碳浓度升高显著提高了地上部生物的20.2%，根系生物量的16.4%，植株总磷积累量的26.8%；而对地上部和根系的磷浓度没有显著影响（图1A）。二氧化碳浓度升高可使根长密度提高17.9%，但对比根长和菌根定殖量无影响。二氧化碳浓度升高还促进了有机酸（琥珀酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、草酸盐和苹果酸盐）的释放，总有机酸阴离子浓度在二氧化碳浓度升高作用下增加了35.4%。二氧化碳浓度升高显著促进了根际土壤碱性磷酸酶活性的37.6%。此外，二氧化碳浓度升高使根际土壤有效磷增加了14.4%，而钙结合态无机磷和中等不稳定有机磷分别降低了16.7%和26.5%（图1B），二氧化碳浓度升高对中等不稳定无机磷和残余磷没有影响（图S1），但土壤全磷含量降低了11.6%（图S1），而微生物生物量磷增加了38.0%（图1B）。在本研究中，小麦磷积累与根长密度、有机酸、碱性磷酸酶活性和速效磷呈正相关，与钙结合态无机磷和中等不稳定有机磷呈负相关（图1C和S2）。

图1. 二氧化碳浓度升高对小麦生长、根系性状、土壤性质及根际土壤磷含量的影响

（A）植株生长（SB、RB、SP、RP、TPA）、形态性状（RLD、SRL、MC）和生理性状（碱性磷酸酶、有机酸阴离子、琥珀酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、草酸盐和苹果酸盐）的响应性。（B）环境二氧化碳（aCO₂）和升高二氧化碳（eCO₂）条件下小麦根际土壤有效磷（H₂O-P_i和NaHCO₃-P_i）、盐酸可提取无机磷（Ca-P_i）、氢氧化钠可提取有机磷（NaOH-P_o）和微生物生物量磷（MBP）含量变化。平均值和标准误差（n = 6）。（C）植物性状与土壤性状与土壤磷组分含量的相关系数。粉色边缘表示正相关，蓝色边缘表示负相关。SB，茎生物量；RB，根生物量；SP，地上部磷浓度；RP，根磷浓度；TPA，植株总磷积累量；RLD，根长密度；SRL，比根长；MC，菌根侵染率；ALP，碱性磷酸酶活性；TOAA，总有机酸阴离子（代表根系渗出）；Ca-P_i，盐酸可提取无机磷；NaOH-P_o，氢氧化钠可提取有机磷；MBP，微生物生物量磷；*** p < 0.001；** p < 0.01；* p < 0.05。

产碱性磷酸单酯酶细菌群落组成与小麦生长（地上部生物量、根系生物量和磷积累）、土壤磷组分、碱性磷酸酶活性和总有机酸阴离子浓度具有显著相关性，而丛枝菌根真菌群落组成与两种二氧化碳环境下的任何植物和土壤参数均无显著相关性（图2I，S5）。丛枝菌根真菌生物量、产碱性磷酸单酯酶细菌丰度和根瘤菌相对丰度与小麦生长、有效磷、碱性磷酸酶活性和有机酸渗出量呈显著正相关，而与钙结合态无机磷和中等不稳定有机磷呈负相关（图2J和S6）。在多样性方面，产碱性磷酸单酯酶细菌的香浓指数与地上部生物量、小麦磷积累量、微生物磷和有机酸渗出量呈负相关。而香浓指数与丛枝菌根真菌优势类群的参数相关性不显著（图2J）。

图2. 不同二氧化碳处理下丛枝菌根真菌和产碱性磷酸单酯酶细菌的特性

（A-H）环境二氧化碳（aCO₂）和升高二氧化碳（eCO₂）下根际土壤丛枝菌根真菌和产碱性磷酸单酯酶细菌的生物量/丰度（A，E）、分类群相对丰度（B，F）、多样性（香浓指数）（C，G）和共生网络（D，H）。*** p < 0.001；* p < 0.05；ns，无显著性。平均值和标准误差（n = 6）。（I）产碱性磷酸单酯酶细菌群落组成与植物性状和土壤性质的相关性。显示这些特征的成对比较，颜色梯度表示斯皮尔曼相关系数。边缘宽度对应于特定距离相关的Mantel r 统计量。（J）土壤微生物群群落丰度与多样性（香浓指数）与植物性状和土壤性质的关系。

二氧化碳浓度升高促进了捕食者的生长，并调节了捕食者的群落组成

与环境二氧化碳相比，二氧化碳浓度升高显著增加了原生动物丰度37.2%，细菌线虫丰度26.0%，真菌线虫丰度27.0%（图3A）。其中，二氧化碳升高环境下原生动物优势类群的相对丰度增加了（Cercozoa增加了16.4%），部分菌食性线虫的相对丰度减少（Mesorhabditis减少了50%，Acrobeloides增加了31.4%）或增加（Cephalobus增加了81.8%，Alaimus增加了130.4%，Acrobeles增加了900.0%，Wilsonema增加了133.3%）。对于食真菌线虫，二氧化碳升高处理使Ditylenchus的相对丰度下降了33.3%，Paraphelenchus的相对丰度下降了54.1%，而Aphelenchus的相对丰度则增加了25.1%（图3B）。

除食真菌线虫外，捕食者微生物群落的香浓指数和群落组成（PCo1评分）在二氧化碳浓度升高处理下发生了显著变化（图3C和S7）。其中，二氧化碳浓度升高处理的原生动物和食细菌线虫的香浓指数分别提高了9.2%和18.6%（图3C）。对于原生动物群落，二氧化碳浓度升高增加了节点数和边数以及平均度，而对连通性没有影响。对于细菌和真菌线虫群落，二氧化碳浓度升高降低了边数、平均程度和连通性（图3D，表S1）。

在两种二氧化碳环境中，原生动物、食细菌和真菌线虫的丰度以及食细菌线虫的香浓指数与丛枝菌根真菌和产碱性磷酸单酯酶细菌的生长、小麦生长、有效磷、微生物磷、碱性磷酸酶活性和有机酸呈强正相关，而与钙结合态无机磷和中等不稳定有机磷呈负相关（图S8）。相比之下，原生动物和食真菌线虫的香浓指数与大多数参数的相关性较弱（图S8）。食真菌和细菌线虫的优势类群也与植物生长性状和土壤性质密切相关（图S6）。此外，细菌线虫群落组成与作物生长、磷组分、碱性磷酸酶活性和有机酸呈显著相关，而食真菌线虫群落组成仅与磷积累、碱性磷酸酶活性和有机酸呈显著相关。在两种二氧化碳环境中，原生动物群落与任何植物和土壤参数都没有相关性（图S5）。

图3. 不同二氧化碳处理下捕食者的特征

（A-D）环境二氧化碳（aCO₂）和升高二氧化碳（eCO₂）条件下根际土壤中原生动物、食细菌和真菌线虫丰度（A）、分类群相对丰度（B）、多样性（香浓指数）（C）和共生网络（D）。*** p < 0.001；* p < 0.05；ns，无显著性。均值和标准误差（n = 6）。

二氧化碳浓度升高增强了根际微生物群间的营养相互作用

在两种二氧化碳环境中，丛枝菌根真菌优势类群的相对丰度与原生动物和线虫优势类群的相对丰度没有显著相关性（图S9）。重要的是，产碱性磷酸单酯酶细菌的优势类群与它们的线虫捕食者有很强的相关性。具体来说，Rhizobiaceae的相对丰度与Mesorhabditis属和Paraphelenchus属的相对丰度呈显著负相关，而与Cephalbus属的相对丰度呈显著正相关（图S9）。

对于整个微生物群群落网络，与环境二氧化碳处理（节点：1014，边：2435）相比，二氧化碳浓度升高处理具有更高的复杂性[共同发生的分类群之间的连接数量（节点：1014，边：2435）]（图4A，B）。在二氧化碳浓度升高处理下，产碱性磷酸单酯酶细菌与原生动物（2277条边）、丛枝菌根真菌与原生动物（112条边）的相关性更高，而产碱性磷酸单酯酶细菌与食细菌线虫（12条边）、原生动物与食细菌线虫（5条边）的相关性更低（图4A，B）。此外，有机酸（图4C）、根际土壤有效磷（图4D）和网络复杂性之间存在正相关关系。中等不稳定有机磷与网络复杂性呈负相关（图4E），表明“上行效应”影响根际微生物群的生长及其营养相互作用。

随机森林结果表明，在土壤磷组分、根系性状和微生物群因子中，两种二氧化碳环境中产碱性磷酸单酯酶细菌活性、原生动物丰度、细菌线虫丰度和真菌线虫丰度对小麦磷积累的影响显著（图4F）。

图4. 不同二氧化碳处理下微生物群落多营养网络共现模式

环境二氧化碳（aCO₂）（A）和升高二氧化碳（eCO₂）（B）。每个节点为丛枝菌根真菌、产碱性磷酸单酯酶细菌、原生动物、食细菌和真菌线虫的分类群。每个节点的大小与连接数（即度）成正比。两个节点之间的连接（即边）表示强（Spearman r > 0.6）和显著（校正p < 0.05）相关。粉色边缘表示正相关，绿色边缘表示两个节点之间的负相关。每个网络的右侧是丛枝菌根真菌、产碱性磷酸单酯酶细菌、原生动物、食细菌和真菌线虫的正、负边汇总，以及节点总数和边总数的统计。粉色和绿色的数字分别表示正边和负边的数量。（C-E）根际土壤总有机酸阴离子浓度（C）速效磷（= H₂O-P_i + NaHCO₃-P_i）和（D）中等不稳定有机磷（氢氧化钠可提取有机磷）（E）与整个微生物群落网络复杂性的潜在关联。（F）土壤性质和微生物变量对土壤有效磷浓度的随机森林平均预测重要性（均方误差增加百分比[MSE]）。蓝色条表示微生物因子；粉色条表示其他因素（土壤磷含量、根系性状）。ALP，碱性磷酸单酯酶活性；TOAA，总有机酸阴离子（代表根系渗出物）；RLD，根长密度。

讨  论

我们发现，二氧化碳浓度提高对小麦地上部磷浓度没有影响，但增加了小麦地上部生物量和总磷积累（图1A）。在二氧化碳浓度升高环境下，由于叶片光合作用和植物生长的增强，磷需求的增加可以通过一系列磷获取策略来满足。研究结果表明，二氧化碳浓度升高增加了小麦根系生物量和长度，并增加了根际土壤中有机酸阴离子的浓度，但对比根长度的影响很小（图1A），这表明促进根系生长和改变生理性状对改善小麦磷的获取至关重要。有机酸阴离子的根分泌在二氧化碳浓度升高条件下通过磷动员获取磷的过程中起关键作用。例如，在缺乏分泌柠檬酸盐能力的小麦基因型中，二氧化碳浓度升高降低了其磷吸收的24%，而在分泌柠檬酸盐的小麦基因型中则没有。同样，Taloy等人也发现，与根系分泌量相对较低的禾草相比，二氧化碳浓度升高通过提高分泌物增加所需要碳投入，增促进了莎草对磷的获取。虽然二氧化碳浓度升高没有增加单位根系上的丛枝菌根真菌的定殖量（图1A），但由于小麦根生长增加（图1），进而导致丛枝菌根真菌的总生物量增加（图2A）。Reichert等人也认为，在二氧化碳浓度升高下，植物可以通过投入更多的碳来支持丛枝菌根真菌的共生（允许增加根外菌丝长度），特别是在土壤中有效磷浓度不太低的情况下。

鉴于上述所有植物增加磷获取的适应策略（即根形态、分泌物和丛枝菌根真菌共生）都消耗光合碳，植物通常选择一种主要策略来获取足够的磷以满足地上部生长需求，如在根形态和渗出物以及根形态和丛枝菌根真菌共生之间进行权衡。然而，二氧化碳浓度升高可能通过提高光合速率来缓解碳约束，这可能是根长增加和根际土壤中磷动员的分泌物浓度升高和/或丛枝菌根真菌生物量增加的协同组合的基础，以加强对有效磷的土壤体积的探索，促进磷的获取。

在我们的研究中，升高二氧化碳浓度显著促进了小麦总磷量的积累（图1A），但二氧化碳浓度升高处理下根际土壤有效磷含量仍高于环境二氧化碳处理（图1B）。这一发现表明，在升高二氧化碳浓度条件下，钙结合态无机磷和中等不稳定有机磷组分的转化补充了有效磷库（图1B）。根际土壤中有机酸阴离子浓度的提高以及根际碱性磷酸酶活性的增强（图1），可以强烈促进二氧化碳浓度升高下碱性土壤中钙结合态无机磷的溶解和有机磷的矿化。此外，二氧化碳浓度升高处理下根际土壤的微生物磷也显著高于环境二氧化碳处理（图1B）。同样，在长期暴露于高浓度二氧化碳的水稻土中，Wang等人（2023）报告了微生物生物量的增加，从而增强了其中的磷固定化，但与本研究相反，其有效磷下降了20%。在二氧化碳浓度升高条件下，植物和微生物之间对磷的竞争可能会降低磷限制系统中植物对磷的吸收，因此低磷环境限制了植物对升高二氧化碳浓度的响应。然而，在集约化农业系统中，即使在升高二氧化碳浓度下微生物生物量中磷的固定化增加，磷肥的投入也足以促进作物生产。此外，在农业系统中，微生物生物量对磷的固定化通常是短暂的，磷可以通过微生物的周转释放，从而增加土壤速效磷含量，促进作物生长。因此，了解磷的形态转化和作物与微生物之间的竞争过程可能是未来升高二氧化碳浓度情景下提高生产力的关键。

在本研究中，二氧化碳浓度升高促进了光合碳分配给根系生物量和有机酸阴离子的分泌（图1），导致细菌和真菌生物量增加（图S3），包括产碱性磷酸酶的细菌和丛枝菌根真菌（图2）。作为基础猎物资源的细菌和真菌可以支持微生物动物的能量需求。因此，我们观察到原生动物、细菌和真菌线虫的丰度显著增加（图3A），这表明根际营养级联具有很强的上行效应。

与环境二氧化碳相比，二氧化碳浓度升高条件下产碱性磷酸单酯酶细菌的多样性显著降低（图2G），群落组成结构显著改变（图S4）。这可能是由于丰度的根际底物（如有机酸阴离子）加强了产碱性磷酸单酯酶细菌之间的竞争，优势分类群（如根瘤菌科，图2F）的相对丰度增加，导致细菌多样性减少。产碱性磷酸单酯酶细菌多样性的降低也表明，在升高二氧化碳浓度条件下，作物可以加强根际过程，招募更有效的溶磷细菌来捕获磷供作物生长，这也表明二氧化碳浓度升高可以促进作物与有益微生物的相互作用。

在我们的研究中，不同的二氧化碳处理没有影响丛枝菌根真菌的多样性和群落组成（图2和S4），尽管丛枝菌根真菌丰度与许多植物和土壤性质密切相关（图2J），但多样性与丛枝菌根真菌的群落组成和植物和土壤性质之间没有相关性（图2J和S5）。相比之下，Cotton等研究表明，在五年的3个生长季节中，二氧化碳升高使大豆根系中Glomeraceae与Gigasporaceae的比例增加。然而，他们还发现，丛枝菌根真菌群落组成的最大差异不是由于不同的二氧化碳处理，而是在不同年份之间检测到的，这表明时间动态非常重要。一般来说，丛枝菌根真菌群落的聚集受土壤pH和养分含量等非生物因素的强烈驱动，而不是受寄主植物的驱动。然而，在本研究中，环境二氧化碳和二氧化碳浓度升高处理中根际有效磷的差异（6.73 vs 7.70 mg kg⁻¹）虽然显著（图1B），但可能不足以影响丛枝菌根真菌群落组成。同样，Maček等也发现，长期的升高二氧化碳浓度显著增加了丛枝菌根真菌丰度，但对丛枝菌根真菌群落组成的影响较小。总的来说，我们的研究结果表明，在二氧化碳浓度升高环境中促进丛枝菌根真菌生物量而不是调节群落组成可能是更有效地获取磷以满足作物生长需求的最佳策略。

二氧化碳浓度升高下，原生动物和食细菌线虫的香浓指数显著升高（图3C）。这可能是由于猎物（细菌）的丰度增加（图S3），导致升高二氧化碳浓度下原生动物和食细菌线虫的稀有物种的相对丰度增加（图3B）。在不同的二氧化碳环境下，产碱性磷酸单酯酶细菌和食细菌线虫的多样性和组成与植物生长和土壤磷组分的相关性比原生动物和菌性线虫更显著（图2、S5和S8）。与真菌和食真菌线虫相比，细菌和食细菌线虫被认为是对环境变化反应迅速的r-策略型（生命周期短、繁殖力高）。升高二氧化碳浓度促进植物光合作用和低分子量化合物（如有机酸阴离子）的渗出（参见图1），这很容易影响r策略下土壤生物群的多样性和组成。例如，产碱性磷酸单酯酶细菌的优势菌Rhizobiaceae或食细菌线虫的优势菌Cephalobus与各种植物生长和土壤参数（包括根际土壤中有机酸阴离子的浓度）之间存在密切的正相关（图S6），这意味着选择性捕食可能不仅在形成产碱性磷酸单酯酶细菌和食细菌性线虫的群落组成方面发挥重要作用，而且在控制植物生长方面发挥重要作用。

在我们的研究中，整个多营养网络（细菌、真菌、原生动物和线虫）在二氧化碳浓度升高下比在环境二氧化碳下表现出更高的拓扑指标（表S2），表明这是一个高度复杂的网络。此外，多营养相互作用，特别是原生动物与微生物（即丛枝菌根真菌和产碱性磷酸单酯酶细菌）之间的联系在二氧化碳浓度升高下显著加强（图4）。在二氧化碳浓度升高作用下，根际土壤中磷有效性的提高和有机酸阴离子浓度的增加（图1），可以通过自下而上的联系，导致微生物群在多营养水平上快速生长（图4）。从而增强了原生动物和微生物之间的相互作用。相反，随着二氧化碳浓度的增加，食细菌线虫与原生动物、食细菌线虫与产碱性磷酸单酯酶细菌之间的关联减弱，且正边显著减少（从64到8），负边显著增加（从1到9）（图4）。鉴于负边表明了网络中的竞争关系，二氧化碳浓度升高可能会加强原生动物和食细菌线虫之间的竞争，从而捕食产碱性磷酸单酯酶细菌，这与胁迫梯度假说相一致。这些发现表明原生动物作为潜在的关键微生物组控制者与微生物组紧密相连。在二氧化碳浓度升高条件下，原生动物与丛枝菌根真菌和产碱性磷酸单酯酶细菌之间的联系更强，这也表明原生动物选择性地捕食细菌和真菌，这可能在气候变化下农业系统土壤磷循环中发挥重要作用。

结  论

二氧化碳浓度升高促进了小麦地上部生长和磷浓度，这可能是由于升高二氧化碳浓度：（1）促进根长和丛枝菌根真菌生长，从而增强有效磷的捕获；（2）增加根中有机酸阴离子的释放，从而增强根际土壤中钙结合态无机磷的增溶作用；（3）刺激产碱性磷酸酯酶细菌的生长，从而通过高碱性磷酸单酯酶活性推动有机磷矿化。升高的二氧化碳还强烈地塑造了根际土壤中多营养微生物群的多样性和组成，并加强了丛枝菌根真菌、产碱性磷酸单酯酶细菌、原生动物以及食细菌和真菌线虫之间的复杂营养相互作用。未来的研究可以集中在长期影响、土壤类型变异性和微生物竞争对磷的作用上。

本研究结果表明，根性状和根际多营养微生物群对升高二氧化碳浓度的协调响应。在不同农业管理方式和气候变化条件下，微生物群营养连锁在作物生长和生态系统功能中发挥着多方面的关键作用。根与多营养菌群的协调可能是有益的，因为它可以加速养分循环，抑制病原菌的生长，从而抑制植物疾病，改善植物健康，这是基于自下而上和自上而下的过程。在环境变化下，根际土壤中需要显著的结构多样性和可塑性来协调根和微生物群营养相互作用，以支撑生态系统服务。

方  法

研究地点和实验设计

FACE系统建立在中国农业科学院农业环境与可持续发展研究所实验基地，位于北京市昌平区（116°8' E，40°8' N），该地区为温带季风气候，年平均气温17.9°C，年平均降水量517.8 mm。土壤类型为棕色潮土。表层（0 ~ 15 cm）土壤初始pH为8.7，有机碳、速效氮和有效磷含量分别为8.18 g kg-1、94.4 mg kg^-1和15.8 mg kg^-1。

本试验于2007年启动，采用小麦-大豆轮作（2007.06-2014.06）和小麦-玉米轮作（2014.10后）两季，包括环境CO₂（环境二氧化碳，415±16µmol·mol^-1）和升高二氧化碳（升高二氧化碳浓度，550±17µmol·mol⁻¹）处理。FACE系统平台由直径4米的八角形环组成。为了尽量减少二氧化碳处理之间的干扰，环之间的距离超过14米。FACE环中的二氧化碳浓度由计算机根据风速和风向实时控制。二氧化碳释放的时间（白天，晚上不释放）由日出和日落自动调节。

试验采用完全随机区组设计，设3个重复。10月初小麦播前基肥分别为氮肥75 kg（尿素）、磷肥72 kg（过磷酸钾）和钾肥75 kg（硫酸钾）。4月底（小麦拔节期）施氮肥（尿素），追肥量为95 N kg ha^-1。

样品采集和测定

植株和土壤样品采集于2022年4月小麦拔节期。在每个图中建立两个子图，获得6个重复样本，以满足复杂的统计分析。在每个小样地，小麦和土壤样品在20 × 20 cm的区域（植物在中心）使用铁锹采集至15 cm深。采样深度的选择基于这两个原因。（1）拔节期小麦根系约50%分布在0 ~ 15 cm土层内。（2）原生动物和线虫主要活跃在0 ~ 15 cm土层。采集样区所有茎、根材料，测定植物生物量和根系形态生理性状。将取样空间内的所有根系小心地从土壤中取出，然后轻轻摇动以除去松散粘附的土壤，留下粘附紧密的土壤称为根际土壤。用细毛刷将根上的土壤刷掉，得到根际土壤。根际土壤样品通过2 mm筛后，分成三部分。一部分用于土壤磷分馏、碱性磷酸酶活性和微生物生物量碳、氮、磷的测定；第二部分-80℃保存，进行磷脂脂肪酸分析和土壤基因组DNA提取；第三部分保存在4℃，用于提取原生动物和线虫。

将根的亚样本反复浸泡在50 ml 0.2 mmol L⁻¹氯化钙溶液中，直到尽可能多地去除根鞘土壤，注意将根损伤降到最低。13000g离心5分钟后，上清液通过0.22 μm注射器过滤器过滤，在10 mL上清液中加入3滴微生物抑制剂Micropur （Sicheres Trinkwasser， Munich， Germany），样品在-20℃下保存，直到使用反相高效液相色谱系统分析羧酸盐（有机酸阴离子）。之后，将根在-20°C冷冻，直到评估形态和干重。

解冻后，在去离子水中洗涤根系，并在爱普生平板扫描仪（V800）上以300 dpi的分辨率扫描，然后用WinRhizo®软件（Regent Instruments，Quebec City，Canada）分析得到根的长度。

每个样品随机选取约50根根尖（长度为1cm），用酸性品红溶液染色，光镜下定量丛枝菌根真菌在根中的定植。剩余的根在75°C下干燥至恒重。比根长为单位干质量根长，根长密度为根长除以土壤体积。

将小麦根、芽粉碎，用5 mL浓硫酸和8 mL 30% v/v H₂O₂的混合物消化。磷浓度采用标准钒钼酸盐法分析。

土壤磷组分和碱性磷酸单酯酶活性的测定

采用微波消解（HNO₃-H₂O₂-HF）后的电感耦合等离子体-原子发射光谱法（ICP-AES，Optima 8300，MA，USA）测定土壤全磷浓度。为保证质量，采用中国国家质量技术监督局标准材料（GBW07446）。

根际土壤磷组分采用改进的Hedley磷分馏法测定。简单地说，就是在0.5 g土壤样品中，通过连续加入不同的萃取剂来测定土壤中磷的成分。（1）用去离子水和（2）用0.5 M碳酸氢钠（pH = 8.5）分别测定水溶性无机磷（H₂O-P_i）和NaHCO₃-P_i，统称“有效磷”。（3）用0.1 M氢氧化钠萃取NaOH-P_i和NaOH-P_o，代表中等不稳定的P（NaOH-P_t）。（4）用1 M盐酸萃取Ca-P_i（磷灰石、其他不同的磷酸钙和吸附在碳酸钙上的磷）。（5）残余磷计算公式为：总磷-有效磷-NaOH-P_t-Ca-P_i。Ca-Pi和NaOH-P_o可以通过动员和矿化转化为有效磷。

采用氯仿熏蒸萃取法对2 g干根际土壤微生物生物量磷浓度进行了分析。以对硝基苯（p-NP）磷酸盐为底物，调节缓冲液pH为11.0，测定了根际土壤碱性磷酸酶活性。碱性磷酸酶活性用mg p-NP g⁻¹ soil h⁻¹表示。

脂质提取分析

中性脂质脂肪酸（NLFA）测定了AMF的生物量，而腐养真菌和细菌的生物量则采用磷脂脂肪酸（PLFA）测定。简单地说，用含有氯仿、甲醇和柠檬酸缓冲液（1：2：8.8，v/v/v）的溶液提取2 g冻干根际土壤样品。然后，中性脂、糖脂和磷脂在硅酸柱上分离。中性脂和磷脂经温和碱性甲醇解转化为脂肪酸甲酯。将脂肪酸（nonadecanoic，19：0）加入到制备的脂肪酸甲酯样品中作为内浓度标准，用HP 6890气相色谱仪（Hewlett-Packard，Wilmington，DE，USA）定量磷脂。AMF生物量由NLFA生物标志物16：1ω5c表示。选用PLFA生物标志物i15：0、a15：0、15：0、i16：0、16：1ω9、16：1ω7t、i17：0、a17：0、cy17：0、17：0、18：1ω7和cy19：0代表细菌生物量，选用PLFA生物标志物18：1ω9c和18：2ω6，9c作为腐养真菌生物量指标。生物量值表示为NLFA 或 PLFA g⁻¹ soil。

Illumina MiSeq测序和生物信息学处理

使用OMEGA土壤DNA试剂盒（M5635-02）（OMEGA Bio-Tek，Norcross，GA，USA）按照制造商的方案从0.5 g根际土壤中提取基因组DNA。提取的DNA溶解在tris-EDTA缓冲液中，用ND-1000分光光度计（NanoDrop Technologies， Wilmington，DE，USA）定量。为评估AMF群落，采用引物AMV4.5NF和AMDGR进行qPCR扩增。引物ALPS-730F和ALPS-1101R通过qPCR扩增细菌phoD基因。利用phoD基因拷贝数评估产碱性磷酸单酯酶细菌的丰度。采用引物TAReuk454FWD1F和TAReukREV3对原虫进行qPCR。

纯化的扩增子在Illumina MiSeq平台（2×300，对端）上测序。通过DADA2插件对序列进行质量过滤、去噪、合并和嵌合序列去除，然后生成扩增子测序变体（amplicon sequencing variant，asv）。分类身份由feature - classifier插件中的classifier - sklearn naïve贝叶斯分类分类器分配给ASV。丛枝菌根真菌的ASV通过对MaarjAM数据库SSU VT参考进行爆破聚类，并命名为相应的虚拟类群（virtual taxa，以下简称VT）。细菌phoD基因的ASV通过对核苷酸序列数据库的爆破进行分类。原生动物采用原生核糖体参考（版本4.5）。将所有样品细化至相同测序深度后，计算丛枝菌根真菌、产碱性磷酸单酯酶细菌和原生动物的α多样性和Bray-Curtis距离。

原生动物的计数

原生动物丰度采用改进的最可能数法测定。简单地说，将5 g新鲜根际土壤悬浮在20 mL无菌水中，以180转/分的速度振荡25分钟。Merck，Darmstadt，Germany）用Neff's Modified Amoebae Saline（NMAS）在96孔微滴板中制备。培养皿在20°C黑暗中孵育9天。3、5和9天后，用尼康Eclipse TS100倒置光学显微镜检测孔中原生动物的存在。原生动物类群的数量由自动分析软件确定，并以个体数g⁻¹干土表示。

数据分析

采用Mann-Whitney U检验来评价与环境二氧化碳相比，升高二氧化碳浓度对植物生长、土壤磷组分、根系性状、丛枝菌根真菌生物量以及产碱性磷酸单酯酶细菌、原生动物、细菌和真菌线虫丰度的影响。利用Spearman相关检验检验了植物性状和土壤性状与土壤磷组分含量之间的关系。

根据微生物群稀薄丰度表计算相对丰度和α-多样性（香浓指数）；然后，通过Mann-Whitney U检验比较两种二氧化碳处理之间的差异。选取相对丰度最高的3个群落作为优势类群，利用Spearman相关系数分析优势类群与植物生长、磷组分、根系性状等环境因子的关系。此外，利用Spearman相关检验检验二氧化碳处理下丛枝菌根真菌生物量、产碱性磷酸单酯酶细菌、原生动物、食细菌和真菌线虫丰度与环境因子的关系，以及五种微生物群落的香浓指数与环境变量的关系。

基于类群的相对丰度，我们使用ASV数据计算了丛枝菌根真菌、产碱性磷酸单酯酶细菌和原生动物的Bray-Curtis不相似矩阵，使用R中的vegdist函数计算了线虫的属水平数据。然后进行主坐标分析（principal coordinate analysis，PCoA），以PCo1评分作为群落组成指标，评估微生物群群落分类组成差异的显著性。利用Mantel检验将微生物群分类群落组成（稀薄丰度表）与环境变量的距离校正差异进行关联，明确了微生物群组成与环境因子之间的关系。

我们构建了相应群落的共现网络，以此可视化每个二氧化碳环境中丛枝菌根真菌、产碱性磷酸单酯酶细菌、原生动物、细菌线虫、真菌线虫以及整个微生物群落之间的潜在相互作用。在整个微生物群落中，将丛枝菌根真菌VTs、产碱性磷酸单酯酶细菌ASV、原生动物ASV以及食细菌和真菌性线虫属结合建立相对丰度表。在网络中，相互作用通过Spearman相关来识别，阈值p < 0.05，相关系数|r| > 0.6；然后，通过Benjamini-Hochberg程序校正p值，以减少获得假阳性结果的机会，最后使用Gephi（10.1版本）软件进行可视化。

为了评估网络的复杂性，我们计算了拓扑参数：丛枝菌根真菌、产碱性磷酸单酯酶细菌、原生动物、细菌和真菌线虫的节点数和边数、平均度和连通性。我们通过使用“igraph”软件包中的“induced-subgraph”功能保存单个土壤样品的种型，提取了整个微生物群落网络的子网络。计算网络复杂度的拓扑参数的第一主成分，包括节点数和边数、平均度和连通性。

为了评估不同因素（土壤磷组分、根系性状和微生物）对小麦磷积累的贡献，我们使用了R中的“随机森林”软件包中的随机森林分析。

所有统计分析均使用R版本4.1.2进行。

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“iMeta” 是由威立、肠菌分会和本领域数百千华人科学家合作出版的开放获取期刊，主编由中科院微生物所刘双江研究员和荷兰格罗宁根大学傅静远教授担任。目的是发表所有领域高影响力的研究、方法和综述，重点关注微生物组、生物信息、大数据和多组学等。目标是发表前10%(IF > 20)的高影响力论文。期刊特色包括视频投稿、可重复分析、图片打磨、青年编委、前3年免出版费、50万用户的社交媒体宣传等。2022年2月正式创刊发行！发行后相继被Google Scholar、ESCI、PubMed、DOAJ、Scopus等数据库收录！2024年6月获得首个影响因子23.7，位列全球SCI期刊前千分之五(107/21848)，微生物学科2/161，仅低于Nature Reviews，同学科研究类期刊全球第一，中国大陆11/514！

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