iMeta | 武汉理工方临川组揭示以丛枝菌根真菌为中心的退化生态系统恢复新机制

丛枝菌根真菌桥接了根相关微生物群对侵蚀坡面多功能性的支持

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引  言

土壤微生物群通过执行一系列基本功能在恢复退化的生态系统中发挥着关键作用，例如碳储存、养分循环、有机物分解和初级生产，尤其是在受严重土壤侵蚀的人工林中。作为恢复的主要生物群区，人工林通过提供有利的生境（如根际）培育了丰富的土壤微生物多样性，从而支持对土壤侵蚀的高水平抵抗力和恢复力。这种能力在很大程度上取决于根际微生物群落内部和与植物间复杂的生物相互作用，特别是真菌和细菌与植物的共生关系。然而，不同的根相关微生物群及其相互作用在多大程度上驱动人工林中多种基本生态系统功能（即多功能性）几乎未知。

刺槐（一种木本豆科植物）被视为恢复退化生态系统的优先物种，这主要归功于它与固氮根瘤菌的有益共生关系和高度的耐侵蚀性。除了根瘤菌共生之外，与丛枝菌根（AM）真菌的互利共生还增强了豆科植物获取有限养分（尤其是磷）的能力。这种菌根联系可能与根瘤菌相互作用，通过改变根相关微生物群对植物生长产生协同效应。据报道，木本豆科植物及其根相关微生物群还通过矿物风化促进额外的养分循环和有机质分解，从而改善其在养分受限的土壤中获取可用养分的情况。尽管如此，有证据表明接种根瘤菌或AM真菌可能会抑制另一方的后续定殖。这些发现暗示了AM真菌和根瘤菌在共进化过程中建立的合作或竞争关系，但迄今为止，我们对刺槐根共生类群和其他微生物群之间相互作用的了解仍然有限。

在刺槐人工林中，各种非生物因素显著影响不同微生物界的多样性或生物相互作用，从而影响生态系统功能的发挥。坡面是刺槐人工林的关键景观特征，也是评估侵蚀生态系统中景观位置影响的基本单位。通过植被的分化和土壤资源的重新分布，坡位可对土壤氮矿化、生物磷利用和生物多样性–生态系统功能关系产生强烈影响。同时，低磷有效性普遍存在于易受侵蚀地区的刺槐人工林，限制了植物生产和微生物驱动的坡面生物地球化学循环。这些高度可变的非生物因素可能会影响共生类群和根相关微生物群的共进化，及其相关的多功能性。不幸的是，关于微生物多样性和功能沿坡面变化的现有知识是分离的，重点仅限于单一微生物界或生态系统功能。此外，普遍采用的微生物相对丰度分析未能比较样本之间的跨界生物关联。这些差距阻碍了我们对自然恢复基本机制的深入了解和相关管理战略的制定。

生态网络是理解复杂生物相互作用的有用工具，可以厘清关键微生物类群在群落构建和生态系统功能中的作用。在侵蚀景观中，网络集群的主要关键分类群已被确定为支持多功能性和减缓侵蚀影响的引擎。同样，微生物网络的复杂性以及真菌/细菌界内和界间的相互作用对于在自然恢复过程中保持多功能性至关重要。一种定量分析方法最近被用于揭示根相关微生物群的新特征，该方法有望阐明AM真菌和根瘤菌的共生表现。鉴于对恢复受侵蚀生态系统的重要性，定量分析刺槐根相关微生物群之间基于网络的相互作用及其与多功能性的联系变得至关重要。

在本研究中，我们调查了黄土高原典型刺槐人工林坡面上根相关微生物群（即AM真菌、根瘤菌和细菌）的多样性和跨界生物关联。黄土高原是一个传统的侵蚀退化地区，但自退耕还林工程启动以来已得到部分恢复。为了确定细菌和共生分类群对生态系统恢复的支持，我们探索了它们与整个坡面生态系统功能的关系，包括个体功能、多维功能和多功能性。这些对坡面多功能性的测量使我们能够在高水平上对功能交付产生一个综合的认识。此外，我们量化了非生物和生物因素的相对贡献和影响途径，以了解微生物群落和坡面多功能性之间的机制联系。我们假设:（1）多功能性的所有组成部分将由根相关微生物群多样性驱动并依赖于后者，其中AM真菌因其减轻刺槐磷限制的优势脱颖而出；（2）由于AM真菌在生态位划分中的重要性，纳入AM真菌相互作用的跨界网络将比单界网络更加紧密地联系在一起；（3）无论资源沿坡面分布如何，AM真菌相互作用将始终支持多功能性，特别是其与根瘤菌的互利共生，通过协同供应氮和磷使刺槐受益。

结  果

生态系统功能沿坡面的变化

置换多元方差分析表明，坡位显著影响多种生态系统功能，进而影响平均多功能性（p < 0.001；图1A，B和表S1）。值得注意的是，与土壤关键服务相关的几项功能水平沿坡面出现下滑，包括微生物驱动的碳库（溶解性有机碳和微生物生物量碳）、养分循环（微生物生物量磷）和有机质分解（乙酰氨基葡萄糖苷酶和亮氨酸氨基肽酶）。相反，在中部和底部观察到相对较高的植物生产（叶片碳含量）。主成分分析确定了坡面多功能性的三个关键维度，共同捕捉了生态系统功能空间变化的68.4%（图1A，C）。其中，第一维度解释了40.1%的变异，由微生物驱动的碳库和有机质分解主导，其分布类似于平均多功能性。

图 1. 坡面多功能性的空间分布

（A）展示12个生态系统功能关键维度的双标图；（B）三个坡位的平均多功能性和（C）多维多功能性。

根相关微生物群及其对坡面多功能性的贡献

尽管坡位内部有较大异质性，但包括细菌、根瘤菌和AM真菌在内的根相关微生物群丰富度在坡位间没有统计显著差异（图2A-C）。然而，限制性主坐标分析的双标图表明坡位对细菌和根瘤菌群落组成的显著影响（p < 0.001），解释的变异分别为13.8%和17.3%（图2D-F）。就这些群落组成而言，整个坡面上的主要细菌类群是根瘤菌目（10.1–11.3%），而根瘤菌的优势属是慢生根瘤菌属（29.2–39.4%；图S1）。随机森林分析确定细菌和根瘤菌组成（限制性主坐标分析的第一轴）和AM真菌丰富度是坡面多功能性的重要预测因子（图2G）。具体而言，AM真菌丰富度通过对溶解性有机碳、微生物生物量磷和β-葡萄糖苷酶的积极影响显著支持多功能性（p < 0.05；图S2）。细菌和根瘤菌的组成对多功能性发挥了更大的调节作用，因为它们与微生物驱动的碳库和有机质分解有很强的关联。此外，土壤氮磷比和有机碳被识别为影响坡面多功能性的关键非生物因素（图2G）。

图 2. 驱动坡面多功能性的根相关微生物群多样性和组成

（A）细菌、（B）根瘤菌和（C）AM真菌丰富度；（D）细菌、（E）根瘤菌和（F）AM真菌群落组成；（G）坡面多功能性的潜在驱动因素。

跨界微生物共生模式和生物关联

为了探索生物相互作用在根相关微生物群共存中的作用，我们构建了细菌和根瘤菌的单界和跨界网络（是否包含AM真菌）。结果表明，当AM真菌相互作用被纳入时，网络联系变得更加相互紧密，并表现出降低的模块性（图3A，B）。值得注意的是，在跨界网络中，拓扑指标（如边数、平均度和聚类系数）始终高于单界网络（表1）。在这些新增的边中，细菌–AM真菌（24.2%）和根瘤菌–AM真菌（28.7%）在其各自的跨界网络中构成了相当大的比例。总的来说，AM真菌相互作用的纳入显著提高了根瘤菌网络的密度，但降低了扩增子序列变体（amplicon sequence variants，ASVs）的中心性（图3C，D）。这导致已确定的关键分类群发生了显著变化，从慢生根瘤菌ASV102变为AM真菌ASV176和ASV186（图3B）。同时，这两个来自AM真菌的ASVs也被认为是细菌跨界网络中的关键物种（图3A），承担了网络连通器的拓扑角色（图S3）。更重要的是，基于群落水平假定生物关联的量化，添加AM真菌相互作用显著降低了细菌网络中的负生物关联，增加了细菌和根瘤菌网络中的正生物关联（p < 0.001；图3E，F）。且正生物关联的强度远远高于负生物关联，这与正负边数比的变化一致（图3A，B）。

图 3. AM真菌相互作用对细菌和根瘤菌生态网络的影响

（A）细菌和（B）根瘤菌单界和跨界（纳入AM真菌）网络的差异；不同坡位网络（C）中心性、（D）密度、（E）负生物关联和（F）正生物关联的比较。

坡面微生物群落构建及其驱动因素

AM真菌的丰富度和跨界生物关联显著影响了优势细菌和根瘤菌的系统发育，慢生根瘤菌是主要的响应类群（图4A，B）。微生物群落的组成和跨界生物关联存在着密切的联系，尤其是根瘤菌与AM真菌间的正和负生物关联（p < 0.01；图4C）。此外，一些非生物因素显示出与微生物系统发育和生物关联的显著相关性，解释了一定比例的微生物组成变化（2.52–5.55%；图4）。具体来说，土壤氮磷比与AM真菌丰富度成正比，而与根瘤菌–AM真菌负生物关联成反比；土壤水分在很大程度上与高AM真菌丰富度有关（图4C）。但总的来说，生物因素对细菌和根瘤菌组成变化的贡献要大得多，分别为24.3%和34.9%（图4D，E）。同时，零模型分析表明扩散限制主导了整个坡面的细菌（88.9%）和根瘤菌（61.4%）的群落构建，其次是漂移（5.23–34.0%；图S4）。然而，不同的AM真菌相互作用显著影响这些随机过程的比例，表现为细菌和根瘤菌分别向变量选择和同质选择的转变（图S5）。

图 4. 坡面优势细菌和根瘤菌组成的系统发育和驱动因素

（A）细菌和（B）根瘤菌分别在目和属水平上优势类群的系统发育树；（C）细菌和根瘤菌组成与非生物和生物因素的关系；解释（D）细菌和（E）根瘤菌群落组成变化的非生物和生物因素的比例。

联系微生物跨界生物关联与坡面多功能性

在整个坡面上检测到12种细菌代谢功能，涉及营养和能量代谢（图5A）。好氧化学异养是主要的代谢途径，约占总功能丰度的40%，其次是暗氢氧化物氧化和固氮。尽管它们的相对丰度较低，但某些代谢功能与跨界生物关联密切相关（图5B）。例如，硫化合物暗氧化和芳香族化合物降解的相对丰度随着正生物关联的强度而增加，而好氧氨/亚硝酸盐氧化和光异养作用则下降（p < 0.05）。我们还探索了跨界生物关联在驱动坡面多功能性中的作用。结果表明，根瘤菌与AM真菌之间较强的正生物关联支持了更高的碱性磷酸酶活性；相反，它们的负生物关联抑制了溶解性有机碳、微生物生物量碳和乙酰氨基葡萄糖苷酶，从而导致多功能性降低（图S6）。偏最小二乘路径模型确定了坡面多功能性由AM真菌丰富度和跨界生物关联直接支持，并通过微生物组成间接调节（图5C，D）。此外，坡位和环境变量通过与微生物特性相互作用共同影响多功能性，特别是AM真菌丰富度和根瘤菌组成（图5C，D和表S3）。根据广义线性混合模型，所有预测因子共同解释了高达91.9%的坡面多功能性的显著变异。

图 5. 坡面微生物间生物关联和多功能性之间的联系

（A）整个细菌界的代谢功能；（B）细菌代谢功能和跨界生物关联之间的显著相关性；（C）微生物特性和其他因素影响坡面多功能性的直接和间接途径；（D）标准化的直接和间接影响。

讨  论

坡位对退化生态系统内生物地球化学循环的影响是一个由土壤侵蚀动力学塑造的复杂过程。在这项研究中，我们通过揭示坡面上多功能性的细微模式阐明了这种复杂性，其多个维度朝着较低的坡位减小（图1）。有趣的是，这种模式与土壤氮磷比从顶部到底部的减少相一致（图2G和表S2），挑战了磷限制加剧阻碍生态系统功能的普遍认识。我们将其归因于化学计量驱动的微生物多样性和组成的变化。化学计量失衡通常会触发微生物的适应机制，导致碳利用效率和酶活性的调整。尽管在氮磷比例严重失衡的高坡位植物生产减少，但这些微生物的适应性极大地改善了微生物驱动的碳库和有机质分解的相关功能（图1A，C和表S1，S2）。此外，内部养分循环可能是磷限制森林生态系统所固有的，其特征是植物对根相关微生物群的投资增加，以实现可利用养分的额外矿化。在这些微生物群中，为植物提供大部分磷需求的AM真菌往往更丰富，并在应对高氮磷失衡方面发挥关键作用（图2C和4C）。

值得注意的是，土壤水分变化对坡面多功能性的影响也不容忽视（图2G和表S2，S3）。水分一直被认为是影响微生物群落和功能的关键因素，特别是在退化景观中刺槐等深根系物种的背景下。我们之前的研究结果还强调，位于低坡位的刺槐表现出较高的生长优势和根际效应，可能导致土壤水分消耗增加。这一过程反映了从坡顶到坡底土壤水分下降的梯度（表S2）。相比之下，AM真菌在上坡位置的富集为刺槐提供了更好的保水能力，土壤水分和AM真菌丰富度之间的强正相关性证明了这一点（图4C）。这些发现意味着植物在建立生物关系方面的策略性投资，特别是在面临重力驱动的坡面资源运输等非生物因素时。因此，受关键资源（如水和养分）可用性调节的复杂植物–微生物相互作用在侵蚀坡面的多功能性中起着决定性作用。

共生微生物和异养微生物是刺槐恢复退化生态系统的关键因素，但鲜有研究。我们对根相关微生物群的研究表明，AM真菌的丰富度以及细菌和根瘤菌的组成显著驱动了坡面多功能性（图2和S2），这与已确定的菌根关联和优势细菌类群的作用一致。此外，独立的测序分别将根瘤菌目和慢生根瘤菌属鉴定为优势细菌和根瘤菌类群（图S1）。基于16S rRNA基因的相对丰度，对rpoB基因丰度的定量揭示了刺槐根际中根瘤菌的显著扩增和选择，尤其是在坡顶（图2B和S1A）。这也再次证实了AM真菌在相关位置的定殖能力增强（图2C），同时支持了我们的第一个假设，即AM真菌满足了具有固氮共生体的植物对磷的大量需求。至于以异养分支为主的细菌，随着植物和凋落物源有机质作为食物来源的可用性增加，它们在较低的坡位生长旺盛（图2A）。

反过来，AM真菌可以调节微生物群落构建的平衡并稳定跨界网络。我们发现扩散限制主要决定了细菌和根瘤菌群落的构建过程（图S4），这可能是由于有限的磷和水分限制了它们的生长或孢子产生。在这种情况下，AM真菌的存在显著增强了网络连通性以及界内和界间的联系，加强了正生物关联（表1和图3）。这得到了大量证据的支持，即在缺水和营养缺乏的生境中，更紧密的微生物共生模式与扩散限制高度相关。因此，AM真菌的丰富度和生物关联加强了根瘤菌的同质分选效果，并稳定了整个细菌界（图S5）。此外，AM真菌相互作用对细菌和根瘤菌的系统发育和组成的贡献比非生物因素大得多（图4），这证实了我们假设的AM真菌在细菌群落构建中不可或缺的作用。单界和跨界网络间的复杂性显著不同，而不是在具有明显环境异质性的坡位间，也再次印证了这一结论（图3C-F和表S2）。

Gemmatimonadales（细菌）和慢生根瘤菌（根瘤菌）是单界网络中的关键分类群（图3A，B），显示出对生态系统氮积累和抵御低水分可用性能力的强有力支持。然而，氮磷失衡导致的磷限制对生态系统的恢复和可持续性构成了威胁。值得注意的是，两个AM真菌ASVs在跨界网络中扮演了连通器和关键物种的角色（图3A，B和S3），突出了AM真菌在支持基本生态系统功能中的关键作用。关键分类群和微生物共生模式的转变强调了刺槐如何富集功能有益的微生物群，自发形成以AM真菌为中心的网络以增强营养获取并缓解磷限制。AM真菌吸收磷能力的增强引发了一系列变化，包括增加的氮固定及后续的根瘤菌共生，这对建立AM互惠作用具有正反馈效应。刺槐的根全生物体（root holobiont）内AM真菌和根瘤菌的这种共进化表明了一种三方共生关系（即豆科植物–AM真菌–根瘤菌共生），很可能对磷限制下坡面多功能性的发挥起到重要贡献。

三方共生已被证明可以通过菌根促进根瘤菌结瘤来增强豆科植物的适应性。这项研究表明，减少的根瘤菌和AM真菌间竞争显著提高了坡面多功能性，特别是在微生物驱动的碳库和几丁质降解方面（图S6A-E）。更重要的是，更强的根瘤菌–AM真菌促进作用将释放更大的磷矿化潜力（图S6F）。在资源有限的侵蚀坡面上，这种协同促进作用也有利于难降解化合物的分解，并通过为化能异养生物分配底物来优化微生物代谢（图5B）。此外，这些共生体之间的代谢相互依赖进一步证实了对根瘤菌分选效果的增强和微生物组成的显著空间变异（图2D，E和S5E，F）。在AM真菌和根瘤菌的共进化中，它们各自的调节因子（PHR2和NIN）在一个共同的信号通路中分别控制着磷与硝酸盐的稳态。从机制上讲，刺槐可能会招募更多的PHR2来协调自身发展和应对整个坡面的氮磷失衡。虽然我们强调了三方共生在增强坡面多功能性方面的作用，但鉴于对侵蚀坡面或类似景观的研究不足，承认其环境依赖性也很重要。未来的研究应该在不同的生态环境中验证这些发现，以更好地了解它们对退化景观中生态系统功能的影响。

即使在考虑了非生物因素的作用后，AM真菌相互作用对坡面多功能性的支持也得到了有力证实（图5C，D和表S3）。如我们的第三个假设所述，无论资源在坡面上的分布如何，磷限制对多功能性的不利影响都将被AM真菌丰富度和生物关联的直接贡献所抵消，特别其是与根瘤菌的互利共生。最近一项关于次生植被演替的研究和我们的研究结果也证实了这一点，即较高的氮磷失衡与AM真菌的存在增加和根瘤菌与AM真菌的负生物关联降低有关（图4C）。此外，细菌和根瘤菌的组成在坡面多功能性中占相当大的比例，这主要是通过生物关联介导的（图5C，D和表S3）。与群落构建和生态系统功能（Community Assembly and the Functioning of Ecosystems）观点相呼应，由AM真菌相互作用驱动的微生物群落构建和组成成为驱动坡面多功能性的关键因素。综上所述，考虑到土壤侵蚀对生态系统服务的深远影响，我们的研究强调了以AM真菌为中心的豆科微生物群在易侵蚀生态系统的可持续恢复中的不可替代性和有效性。

结  论

本研究提供了AM真菌相互作用与刺槐人工林内坡面多功能性传递密切相关的经验证据，特别是在微生物驱动的碳库和有机质分解方面。在整个侵蚀坡面上，AM真菌丰富度以及细菌和根瘤菌组成共同驱动了具有明确空间变异的多功能性，且AM真菌的相互作用在细菌和根瘤菌群落构建方面起着关键作用。为了应对磷和水分的限制，刺槐策略性地招募AM真菌，在根际形成以AM真菌为中心的网络。更重要的是，刺槐–AM真菌–根瘤菌三方共生有力地支持了坡面多功能性。我们必须强调的是，这源于刺槐增加了对生物关系的投资。在降雨量足以维持森林群落的情况下，这种共生关系对于利用刺槐恢复退化土地的成功与否至关重要。然而，从历史上看，在退化土地的森林恢复中使用的木本豆科物种的数量不成比例。但至少，我们的发现为恢复侵蚀导致的退化生态系统以及依赖这些生态系统的不可或缺的生物多样性和服务提供了重要线索。

方  法

研究地点

研究地点位于黄土高原中部的固屯流域，属于暖温带季风气候区，年平均气温和降水量分别为10.6 ℃和531毫米。降雨不均，主要集中在7月至9月。实验设计严格遵循先前研究中概述的方法。具体而言，重点关注流域内刺槐人工林的坡面，其特征是黄绵土和26°的坡度。在这个坡面上，划定了一个60米× 30米的区域，并沿着三个平行的样带进行了调查（图S7）。每条等长（60米）的样带从左至右间隔10米。以这些60米的样带为基础，在每个样带的三个位置（顶部、中部和底部）以20米的间隔建立，并进一步划分为两个地块。因此，整个坡面共有18个地块（10米 × 10米），每个坡位有6个重复。

植物和土壤样品采集

2019年9月，我们实施了一种S形方法来收集每个地块的复合样品（来自五个核心），包括植物组织和土壤样品。植物组织由成熟的叶片和凋落物组成。对于土壤样品，我们采用了一种综合策略，即采集根际和非根际土壤。这包括挖取根部，用2毫米的筛子筛选土壤，并按照标准程序将其分离。具体来说，根际土壤被小心翼翼地从紧密附着在根上的土壤中刷掉，并储存在80 ℃下用于随后的DNA提取。大块土壤直接从根部移走，每个样品分成两个子样品。一个子样品立即在4 ℃下保存，以供后续测定生态系统功能，而另一个子样品经过自然风干用于土壤理化分析。

土壤理化分析

我们评估了与根相关微生物群活动密切相关的非生物因素，包括土壤水分、容重、pH、有机碳、总氮和总磷。使用大型取样器和直径为5厘米的不锈钢切割环分析土壤容重。其他非生物因子的测定遵循先前建立的方法。简单地说，土壤含水量是通过在105 ℃下烘干10克新鲜土壤来确定的。土壤pH在1:2.5质量体积比的浆液中用pH计（InsMark IS126，上海）测定。通过硫酸-重铬酸钾外部加热法测定有机碳。总氮和总磷的测定采用标准化方案，即凯氏定氮法和钼锑比色法。由于观察到有机碳和总氮之间的多重共线性，我们在统计分析中用土壤氮磷比代替总氮，计算为总氮与总磷的比值。

生态系统功能测定

我们采用先前研究的方法，量化了与四种基本服务相关的12个生态系统功能。这些功能包括微生物驱动的碳库（溶解性有机碳和微生物生物量碳）、养分循环（总溶解氮、有效磷、微生物生物量氮和微生物生物量磷）、有机质分解（β-葡萄糖苷酶、乙酰氨基葡萄糖苷酶、亮氨酸氨基肽酶和碱性磷酸酶）和植物生产（叶片碳含量和凋落物碳含量）。通过60 ℃烘干至恒重，然后研磨和重铬酸钾外部加热来测定叶片和凋落物的碳含量。用硫酸钾提取溶解性有机碳和总溶解氮，并使用全碳分析仪（Elementar，德国）测定浓度。用碳酸氢钠提取有效磷并用分光光度计（日立UV2300）测定。用氯仿熏蒸45克新鲜土壤24小时后，用硫酸钾提取微生物生物量碳和氮，并使用总碳分析仪进行测定，而用碳酸氢钠提取微生物生物量磷，并使用分光光度计进行测定。分别采用0.45、0.54和0.40的转换系数计算微生物生物量碳、氮和磷。使用荧光法从1克新鲜土壤中测定β-葡萄糖苷酶、乙酰氨基葡萄糖苷酶、亮氨酸氨基肽酶和碱性磷酸酶的活性，7-氨基-4-甲基香豆素和甲基伞形酮分别作为亮氨酸氨基肽酶和其他酶的标记底物。为了便于分析，我们通过z-score变换对12个生态系统功能进行了标准化（表S1），得出了坡面上每个地块的多功能指数。该指数概括了同时提供多种生态系统服务的能力。多功能性的三个方面被考虑:（I）多个单一功能；（II）平均多功能性，通过对12个标准化生态系统功能进行平均计算得出；以及（III）多维多功能性，通过主成分分析的三个主轴进行评估，这些主轴可以处理测量的生态系统功能之间的潜在共线性。

扩增子测序和分子生物学分析

使用ALFA-土壤DNA提取微型试剂盒从18个根际土壤样品中提取基因组DNA。为了阐明根系相关微生物群落的丰富度和群落组成，我们使用特定的引物对扩增了细菌16S rRNA、根瘤菌rpoB和球囊霉门18S rRNA基因，分别为：341F (5′-CCT ACG GGA GGC AGC AG-3′) / 806R (5′-GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT-3′)、rpoB1479F (5ʹ-GAT CGA AAC GCC GGA AGG-3ʹ) / rpoB1831R (5ʹ-TGC ATG TTC GAG CCC AT-3ʹ)和NS31 (5ʹ-TTG GAG GGC AAG TCT GGT GCC-3ʹ) / AMDGR (5ʹ-CCC AAC TAT CCC TAT TAA TCA T-3ʹ)。扩增子测序和生物信息处理使用Illumina MiSeq平台和QIIME2管道中的DADA2进行。在100%相似性水平上鉴定了谱系型，即ASVs。在解复用和质量过滤之后，最终保留并聚类了总共50,154个细菌ASVs、4542个根瘤菌ASVs和2807个AM真菌ASVs。使用SILVA SSU132数据库对细菌ASVs进行分类。对于根瘤菌ASVs，只有来自变形菌门进化枝的rpoB基因序列被保留并在属水平进行了注释。AM真菌则利用MaarjAM数据库来分配球囊霉门18S rRNA基因序列。细菌代谢功能的预测是通过将16S rRNA扩增子序列分配给FAPROTAX数据库完成的。

生态网络和生物关联推断

SPIEC-EASI算法在处理群落组成的偏差方面非常稳健，该算法被用于推断根相关微生物群（AM真菌、根瘤菌和细菌）的单界和跨界网络。对于每种微生物群，仅保留大于25%的样品出现频率、相对丰度超过0.001%的优势ASVs用于网络分析。使用“microeco”R软件包（版本0.17.0），ASV表单独或被合并用于构建单界或跨界网络。两种网络类型的拓扑特征，包括节点和边的数量（正和负）、平均度、平均路径长度、模块性、网络直径和密度，均使用“igraph”R软件包（版本1.4.0）进行计算。利用“subgraph”功能，进一步计算了单个样本子网络或跨界网络子集的拓扑特征。根据广泛采用的标准计算了节点的模块内连通性（Z）和模块间连通性（P）并对跨界网络中节点的拓扑角色进行分类。具体来说，模块枢纽（Z > 2.5，P < 0.62）、网络枢纽（Z > 2.5，P > 0.62）和连通器（Z < 2.5，P > 0.62）被分类，其他节点被识别为外部节点。利用Kleinberg枢纽中心性得分阈值大于0.7确定了关键分类群。使用“qcmi”R软件包（版本0.1.2），通过ASVs丰度及其正负连通性的矩阵相乘来量化群落水平生物关联。

群落构建过程的零模型分析

基于零模型的方法估计细菌和根瘤菌群落的构建过程，这种方法使用特定的阈值从系统发育度量中推断选择。例如，β-多样性指标（βNTI）和基于Bray–Curtis距离的Raup-Crick值（RC_bray）。当|βNTI| > 2时，确定性过程（变量选择或同质选择）占优势，而当|βNTI| < 2时，随机过程控制群落构建。在这种情况下，|RC_bray| > 0.95和|RC_bray| < 0.95分别表示同质扩散或扩散限制和漂变的优势。使用“iCAMP”R软件包（版本1.5.12），通过1000次随机化来计算βNTI和RC_bray。

统计分析

使用“lmerTest”R软件包（版本3.1-3），采用线性混合效应模型分析坡位对根相关微生物群丰富度和生态系统功能（单个功能、多维功能和多功能性）的固定效应，地块作为随机效应。对整个坡面多种生态系统功能的空间变化进行了主成分分析。从主成分分析结果中，提取前三个轴的解释方差和特征值来评估多维多功能性。使用“vegan”R软件包（版本2.6-4），通过999次置换多元方差分析检验了不同坡位间多维功能的显著差异。执行基于Bray–Curtis距离的限制性主坐标分析，以探索每种微生物群组成因坡位而产生的最大可解释变异。使用“rfPermute”R软件包（版本2.5.1），采用了包含500棵树和1000次置换的随机森林分析来确定驱动坡面多功能性的主要因素。这些因素的重要性和随机森林模型的显著性分别利用均方误差的百分比增长和“A3”R软件包（版本1.0.0）进行评估。斯皮尔曼相关性分析用于检验整个坡面上微生物群、环境因素和生态系统功能之间的关系。曼特尔检验用于确定单个驱动因素（即非生物和生物因素）对细菌和根瘤菌群落构建和组成的影响。进行方差分解分析以比较非生物和生物因素分别对细菌和根瘤菌组成的相对贡献。使用“plspm”R软件包（版本0.5.0），采用偏最小二乘路径模型确定所有因素直接或间接影响坡面多功能性的途径。所构建的偏最小二乘路径模型的信度和效度通过三个标准进行评估和接受：拟合优度 = 0.6、提取的平均方差 > 0.5和Cronbach’s α > 0.7。利用“glmm.hp”R包（版本0.1-0）中建立的广义线性混合模型额外估计所有因素的固定效应和独立的解释比例。所有统计分析和可视化均使用R统计软件（版本4.1.2）进行。

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“iMeta” 是由威立、肠菌分会和本领域数百千华人科学家合作出版的开放获取期刊，主编由中科院微生物所刘双江研究员和荷兰格罗宁根大学傅静远教授担任。目的是发表所有领域高影响力的研究、方法和综述，重点关注微生物组、生物信息、大数据和多组学等。目标是发表前10%(IF > 20)的高影响力论文。期刊特色包括视频投稿、可重复分析、图片打磨、青年编委、前3年免出版费、50万用户的社交媒体宣传等。2022年2月正式创刊发行！发行后相继被Google Scholar、SCIE、ESI、PubMed、DOAJ、Scopus等数据库收录！2024年6月获得首个影响因子23.7，位列全球SCI期刊前千分之五(107/21848)，微生物学科2/161，仅低于Nature Reviews，同学科研究类期刊全球第一，中国大陆11/514！

“iMetaOmics” 是“iMeta” 子刊，主编由中国科学院北京生命科学研究院赵方庆研究员和香港中文大学于君教授担任，是定位IF>10的高水平综合期刊，欢迎投稿！