iMeta | 李地艳/刘永鑫/毛如荣-揭示阴道微生物群影响不孕症女性体外受精的妊娠结局

阴道微生物群影响不孕症女性体外受精的妊娠结局

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引  言

女性不孕症是一个多方面的健康问题，由阻碍生殖能力的单一或多种因素引起。在20至44岁的女性中，约有2%-10.5%患有此病，可导致原发性和继发性不孕症。这种情况可能是先天性因素以及激素不规律，生活方式差异及环境因素共同作用的结果。众所周知，女性不孕症的原因有排卵问题、多囊卵巢综合征、输卵管问题、子宫问题和子宫内膜异位症等。这些原因也被认为与生殖微生物群的紊乱有关，生殖道微生物群的改变也可能导致女性不育。不断上升的不孕症患病率，导致对辅助生殖技术（ART）的需求越来越大，同时该技术也变得更加安全和有效。旨在克服不孕症和实现成功怀孕的体外受精（IVF）已在全球使用近四十年。

阴道微生物群在维持阴道健康和保护宿主免受疾病侵害方面起着重要作用。它可受到宿主生理上的影响，也可以影响宿主生殖生理本身。人们对影响女性生殖和后代健康方面的微生物群十分关注。已知的阴道病原体（如结合支原体，沙眼衣原体和淋球菌等）有可能会导致不孕。同时，导致细菌性阴道病（通常由阴道加德纳菌引起）的微生物群临床变化也被认为与流产风险增加有关。这些研究表明，与健康和有生育能力的女性相比，不孕症患者拥有独特的生殖道微生物群（包括上生殖道和下生殖道）的可能性越来越大。除了阴道健康，其微生物组的组成似乎也与自然受孕和ART周期成功的可能性有关。

因此，考虑不同类型不孕症妇女生殖道微生物组成是否会影响到IVF结果是十分重要的。研究表明，阴道微生物组可以预测IVF的结果。在这项研究中，我们系统地对来自一个大型育龄女性群体的1411名不孕症女性的阴道微生物群进行采样（图1A）。通过16S rRNA基因扩增子测序对细菌群落进行分析，并对71位女性进行进一步宏基因组测序。该研究揭示了临床和生化指标与不孕症之间的相关性，不仅确定了与临床和生化指标相关的微生物组特征，还分析了与IVF结局相关的潜在细菌标志物。

图1. 阴道微生物群的组成与不同生理生化指标间的相关性

(A)1411例不孕妇女样本信息、阴道微生物群和表型综合分析概述；(B)11个指标之间的斯皮尔曼相关性。圆圈的大小代表|r|，p值的统计学显著性；(C)根据相对丰度的中位数，不同水平（即门、属和种）的阴道微生物群的组成。将组成<1%的微生物群的分类群组合并标记为“其他”；(D)不同属间的斯皮尔曼相关性。* p < 0.05，** p < 0.01，和* p < 0.001。CS，慢性输卵管炎；ED，子宫内膜炎；EDO，子宫内膜异位症；FB，输卵管问题；FTO，输卵管阻塞；HD，输卵管积水；INF，炎症；IUA，宫腔黏连; IVF，体外受精；OF，排卵失败；PCOS，多囊卵巢综合征；PID，盆腔炎性疾病；POI，卵巢功能不全；SLP，输卵管切除术；SU，瘢痕子宫。

结  果

阴道微生物的表型和组成

对1411名被诊断为不孕不育的女性，平均年龄为31.66岁（±5.21标准差，SD），平均体重指数（BMI）为22.33（±3.28标准差）的生理生化指标进行分析。多次校正后，黄体生成素（LH）、催乳素（PRL）和抗缪勒激素（AMH）的水平与女性年龄呈负相关（P<0.05），促卵泡激素（FSH）与其呈正相关。血清PRL水平也与AMH呈正相关（图1B）。对1411份阴道样本进行16S rRNA基因测序分析，共产生112,635,137个高质量序列，平均每个样本79,826个reads，样本的平均良好覆盖率为99.83%。通过100%相似性聚类，共鉴定出1550个与操作分类单位（OTU）代表性序列对应的扩增子序列变体（ASV）。随后，我们将这些ASVs分为446属、215科、137目、68类和35门。使用25个空白对照样本进行可能的微生物污染去除后，我们保留了丰度>1%或者至少在15%的样本中出现的微生物类群用于后续的分析，包含了15个属和26个种。在门水平上，最常见的是厚壁菌门，其次是放线菌门和拟杆菌门。在属水平上，阴道菌群主要由乳酸杆菌组成，其次是加德纳菌、普雷沃特氏菌、链球菌和范尼赫西菌。不同种类的乳酸杆菌（约占相对丰度的77.57%）是育龄妇女阴道中的优势菌。在种水平上，我们检测到以下属于乳酸杆菌属的菌种：惰性乳杆菌（41.54%）、卷曲乳杆菌（31.12%）、詹氏乳杆菌（2.63%）和人乳杆菌（1.41%）。对于加德纳氏菌属，最丰富的种类是加德纳氏菌（12.21%）（图1C）。进一步对15个属和26个种进行分析，我们发现乳酸菌广泛分别与其他14个属的丰度呈负相关（P<0.05）。加德纳菌（Gardnerella）和普雷沃特氏菌（Prevotella）分别与13属和11属呈显著正相关（P<0.05）（图1D）。在物种水平上，发现惰性乳杆菌和卷曲乳杆菌与大多数其他种的丰度呈负相关。

不孕症妇女阴道微生物群落类型

为了进一步了解阴道内微生物群落的变化，我们使用VALENCIA（一种最近的基于质心的分类方法）检测所有样本的群落状态类型（CST）。基于它们与一组参考质心的相似度，我们发现所有空白对照组的25个样本相似度得分都较低（均小于0.3）。因此，我们保留这些相似性得分大于0.3的阴道样本（1391个样本）来进一步分析。该分析揭示微生物群落的五个主要类群和九个亚类（图2A），这与之前发表的人类阴道微生物多样性研究中确定的类群相似。这五个群落类型分别为I、II、III、IV和V，分别包含467、11、653、240和20个样本。每个CST样本的物种水平分类组成，通常与相关参考中心点的分类组成一致（图2B）。正如预期的那样，香农多样性在亚CSTs中存在差异，包括I-A（308）、I-B（159）、II（11）、III-A（471）、III-B（182）、IV-B（208）、IV-C1（25）、IV-C3（7）和V（20）。I-A组和III-A组的香农指数较低（图2C）。为了研究不同CST微生物共存的一致性，我们接下来计算每个CST中细菌物种之间的相关性。样本数超过180个的五种群落类型共存的细菌网络之间显示出一些差异：(i)CST I-A、III-A和IV-B微生物群有两个相互关联群落，而CST I-B和III-B微生物群分别有四个和三个相互关联的群落（图2D）。五个CST之间共享16条边（图2E）；(ii)五个CST之间共享节点的接近度和特征向量也有很大差异（图2D），III-A和III-B分别有10条和12条独特的边（图2E）；(iii)惰性乳杆菌与CST I-A和IV-B中的其他物种大多呈正相关，而与其他三个CST中的大多数细菌呈负相关。在属水平上，乳酸杆菌在IV-B微生物群中既有正相关又有负相关，而在其他四个CST微生物群中仅显示为负相关；加德纳菌与其他属大多数细菌呈负相关，而与其他四个CST中的大多数细菌呈正相关。

图2. 育龄妇女阴道微生物群的多样性和组成

(A)根据阴道微生物群落类型，基于属水平的非加权UniFrac距离，对1391个样本进行主坐标分析（PCoA）。(B)根据VALENCIA标准，按群落状态类型（CST）分类的所有留存样本（n = 1391）的物种组成。CST I-A几乎完全是卷曲乳杆菌；CST I-B的卷曲乳杆菌较少，但仍占多数；CST II群落主要是加氏乳杆菌；CST III-A几乎完全是惰性乳杆菌；CST IV-B含有较高和中等的阴道加德纳菌和阴道阿托波菌；CST IV-C1以链球菌属为主；CST IV-C3型以双歧杆菌属为主；CST V群落以詹氏乳杆菌为主。(C)基于香农指数的阿尔法多样性小提琴图。(D)在种水平上，每个亚CST样品中共发生的细菌网络。每个网络都是通过计算具有显著Pearson相关系数的共存细菌而创建的。节点属性：(i)圆圈大小，与归一化和标准化细菌相对丰度成正比；(ii) 颜色，由Louvain算法检索的群落。边缘属性：(i)厚度，与Pearson相关系数的P值成正比，从最显著（较厚）到不太显著（较薄）；(ii)颜色，红色表示Pearson相关系数为正，绿色表示Pearson相关系数为负。(E)五个CST之间唯一和共享边缘的数量。(F)五个CST共现网络中节点的中心性（亲密度等级）和差异。

阴道微生物群与生化和临床测量的关系

CST是根据属水平上的阴道微生物群组成提出的（图3A,B）。为了探究阴道微生物群与生化和临床测量结果之间的关系，我们使用斯皮尔曼相关分析计算了阴道微生物群的相对丰度与属水平上11种生理生化指标之间的相关性。只有少数微生物与一项或多项指标有显著相关性（P < 0.05）。研究发现，雌二醇（E2）与最大数量的微生物有显著相关性（图3C）。热图显示与临床或生化测量结果相关的属的微生物类群丰度（图3D）。在育龄妇女中，发现乳酸杆菌的相对丰度与年龄呈正相关（P < 0.05），这表明随着女性年龄的增长，这些细菌在阴道中的定植量增加。此外，戴阿利斯特杆菌属、普雷沃氏菌属和双歧杆菌属的相对丰度与LH呈负相关（P < 0.05）。韦荣氏球菌属、戴阿利斯特杆菌属、埃希氏菌属、志贺氏菌属、奇异菌属、沙雷氏菌属、巨单胞菌属和链球菌属的相对丰度与E2呈正相关（图3C，D）。此外，还绘制了11个测量值和α多样性值的分布图（图3E）。这些结果通过丰度最高50%和最低50%的样本之间的线性判别分析效果大小(LEfSe)分析得到证实。例如，乳酸杆菌是年龄的生物标志物，阴道芽孢杆菌是体重的生物标志物。同时还绘制阿尔法多样性值的分布图（图3F）。

图3. 1391名育龄妇女的微生物区系丰度热图与4项生化指标和7项临床观察结果显著相关

（A）阴道样本分为九个亚型。（B）阴道细菌群落中丰度前10的属在不同样本中分布情况。（C）基于斯皮尔曼相关系数图谱的分类群完全关联聚类，斯皮尔曼相关系数图谱是指在样本的属组成和测量评分之间计算出的一组斯皮尔曼相关系数。黄色片段表示这些测量值与属水平之间的正相关；绿色片段表示负相关。*、**，和***分别代表P < 0.05、P < 0.01和P < 0.001时的显著差异；abs（cor）代表斯皮尔曼相关系数的绝对值。(左上角标有颜色键）。（D）1391名育龄妇女中15个属的丰度热图（右上角标有颜色键）。（E）1391个样本中每个样本的11个生理生化指标。（F）计算1391份阴道样本的香农多样性指数。

不同类型不孕妇女阴道微生物组的差异

对于所有1411个样本，我们记录每个患者被诊断的症状（多囊卵巢综合征、卵巢功能不全、慢性输卵管炎、子宫内膜炎、盆腔炎、子宫内膜异位症、宫腔粘连、瘢痕子宫、排卵失败、输卵管积水、输卵管阻塞或输卵管切除术）。无任何女性不育症状且性伴侣诊断为无精子症、少精子症、弱精子症或精子畸形的患者的180份样本被认为是“男性因素”组(对照组)。在1231名不孕妇女中，大多数（783人，63.61%）被诊断为炎症，即慢性输卵管炎、子宫内膜炎和盆腔炎。此外，其中976人（69.17%）患有输卵管不孕症（包括慢性输卵管炎、输卵管阻塞和输卵管积水），其中758人被诊断为慢性输卵管炎症。此外，423名（34.36%）患者被诊断出至少患有两种疾病。在这11项生理生化指标中，与对照组相比，患有多囊卵巢综合征、子宫内膜异位症和AMH水平较低的女性显示出最多的差异。接下来，在对照组和每个不孕组之间进行LEfSe分析。在AMH较低和宫腔粘连的女性中，分别鉴定出12和7个不孕相关细菌类群，大肠杆菌与多囊卵巢综合征有关。这些结果表明，不同不孕症状的育龄妇女的阴道微生物组组成存在一些差异。探讨不同群落类型在每个不孕不育组中的分布，III-A型样本显示瘢痕子宫高度分布（n = 81）。IV-B型样本比例最高的是被诊断为输卵管切除术的女性（图S6）。

阴道微生物群组成与体外受精结果的关系

在1391名女性中，1236名在第3天或者第五天接受了IVF或IVF-ICSI（胞质内精子注射），并移植新鲜或冷冻胚胎。在这些妇女中，654人（52.91%）在胚胎移植（ET）后14天检测到人绒毛膜促性腺激素（hCG）阳性，621人（50.24%）在ET后35天被检测到心跳（考虑怀孕）。剩下的615名妇女被认为未怀孕。此外，对照组（65.61%）、PCOS组（58.39%）和FTO组（54.81%）在IVF或IVF-ICSI后显示出较高的hCG阳性率（图4A）。对于11项生理生化指标，我们还分析了它们与hCG阳性率和妊娠率的关系（图4B）。只有年龄、AMH和LH对妊娠率有显著影响（P<0.05）。

接下来，我们分析每组女性的细菌群落类型。I型和III型的女性人数最多，分别为408人（33.01%）和589人（47.65%）。与I‐B和III‐B相比，I‐A和III‐A亚型的hCG阳性和怀孕的比例更低一些（I‐A型，44.81%；III‐A型，51.07%；I‐B型，54.35%；III‐B型，57.74%）。IV-B型包括183名妇女，其中88人（48.09%）怀孕（图4C）。CST I‐A、I‐B、III‐A、III‐B和IV‐B中的样品分别由乳杆菌占97.04%、89.33%、95.61%、79.87%和13.38%（图4D）。詹氏乳杆菌是该CST的生物标志物，其妊娠率最高（图4E）。此外，IV-B中加德纳菌的丰度更高，但这种CST并没有降低妊娠率。当我们在该CST中检查怀孕和非怀孕组之间的差异时，我们发现乳酸杆菌是怀孕组的生物标志物（图4F）。

图4. 阴道微生物群组成与体外受精（IVF）结果的相关性

（A）与对照组相比，对每个不孕不育组中怀孕的女性进行分析，一些被诊断为有不止一种症状的女性将被用于多次计算。与对照组相比，每组的p值显示在列中。（B）每个指标最高和最低50%样本之间的妊娠率比较，，卡方检验用于比较各组和对照组的试管婴儿结果。P值显示在每次测量的列上方。（C）每种社区状态类型（CST）的妊娠结果分布。（D）每种类型的阴道微生物组在属（左图）和种水平（右图）的组成。（E）通过线性判别分析-效应大小（LEfSe）分析，在物种水平上确定了五种CST与细菌分类群之间的关联。（F）LEfSe鉴定CST IV‐B中孕妇和非孕妇与细菌分类群之间的相关性。BMI，体重指数；E2，雌二醇；f，科；g，属；T，睾酮；o，目；P，黄体酮。

从宏基因组角度看不孕不育阴道微生物组示意图

微生物组，鉴于其在人类健康和疾病中的关键作用，显著地改变了现代生物学。我们进一步对71个阴道样本的基因组DNA进行宏基因组测序。经过宏基因组组装和分类学注释，结果表明，大多数类群被分配到乳杆菌科（约占相对丰度的33.78%）、双歧杆菌科（15.78%）和普雷沃氏菌属（约4.31%）。在属水平上，与16S rRNA测序结果相同，阴道菌群也以乳杆菌为主，其次是加德纳菌和普雷沃氏菌属（图5A）。只有乳酸杆菌在孕妇中的丰度显著高于非孕妇（P<0.05）。另一方面，加德纳菌在多次移植后未怀孕患者中丰度显著较高（P <0.05）（图5B）。在物种水平上，詹氏乳杆菌在怀孕者中表现出相对较高的丰度（P <0.05），这与之前的16S rRNA结果一致（图4E），即詹氏乳杆菌是妊娠率最高的CST III‐B的标志物。与怀孕者相比，未怀孕者含有更多的注释基因（图5C）和抗微生物耐药性基因（ARGs）（图5D）。未怀孕妇女抗生素耐药性分析表明最高的三个基因是tetM、rpoB和vanT，它们与四环素、利福平和万古霉素抗生素的药物类别有关。相比之下，qacJ、tetM和ErmB分别是怀孕组中与四元铵化合物、四环素和大环内酯类抗生素药物类别相关。根据碳水化合物活性酶（CAZy）中所有基因的功能注释和丰度信息、基因进化谱系：无监督同源（eg: NOG）和京都基因和基因组百科全书（KEGG）数据库，比较了两组微生物基因编码的途径，这与淀粉降解密切相关。与人类疾病相关的KEGG途径，包括未怀孕组的“耐药性：抗肿瘤”和“传染病：寄生虫”，明显高于怀孕组（图5E）。而“膜转运”和“传染病：细菌”途径在怀孕组中的比例更高。

图5. 怀孕和未怀孕组阴道宏基因组的组成和功能差异

（A）根据相对丰度中位数，不同级别（即目、科和属）的阴道微生物群的组成。（B）怀孕和未怀孕组前两个属和一个物种的相对丰度。两组妇女的总注释基因数（C）和抗微生物耐药性基因数（D）。（E）根据（京都基因和基因组百科全书）KEGG数据库分类的功能和系统发育注释直系同源的相对丰度。

讨  论

不孕症女性阴道微生物群的群落类型和功能

我们对1411名被诊断为不孕症的正常性生活女性的阴道微生物群进行特征分析。不同不孕症症状的女性存在五种主要的阴道细菌群落，这与先前的研究结果一致。正如之前报道的那样，IV型群落中加德纳菌丰度较高，乳酸杆菌丰度较低，这可能对应着更多样化的阴道微生物群。个体间阴道微生物群群落的差异可归因于先天免疫系统和适应性免疫系统。此外，阴道分泌物的组成和数量，以及上皮细胞表面的配体，可能在形成不同的阴道群落中起关键作用。此外，不同的生活习惯、种族和活动也会产生巨大的影响。本研究对阴道微生物进行了组成和宏基因组分析，以更好地利用宏基因组数据，全面了解阴道微生物功能及其与怀孕的关系。在基因组注释后，我们发现未怀孕的个体与怀孕的个体相比具有更高的抗生素抗性基因数量和丰度。此外，宏基因组分析显示，未怀孕的微生物群在“环境适应”、“耐药:抗肿瘤”和“传染病:寄生”途径中富集。这些因素可能有助于解释为什么阴道微生物群中耐药基因数量较多的个体，其体外受精结局较差。尽管如此，我们的研究提供人类阴道微生物群中抗生素耐药基因的全面概述。

阴道微生物与11项生理生化指标的相关

随后，我们研究了微生物与11项生理生化指标之间的相关。这与先前的一项研究一致，该研究表明雌激素水平显著影响了阴道微生物组的组成；此外，志贺氏菌等9个属与E2和其他激素显著相关(P < 0.05)。雌激素，以促进糖原的合成和储存而闻名，在青春期前的女孩和绝经后的女性中，其水平很低。因此，绝经后个体的微生物群包含多种厌氧菌也就不足为奇了。研究指出，BRCA突变的绝经前妇女的激素E2和孕酮(P)水平较高；表明P可能会影响阴道上皮细胞，潜在地抵消雌激素并导致微生物群失衡。此外，研究发现肠道细菌可影响雌激素代谢，从而影响阴道上皮细胞。范尼赫西菌(Fannyhessea)和柠檬酸杆菌(Citrobacter)是细菌性阴道病相关属，已被广泛研究。本研究发现它们与E2呈正相关。有研究表明，扇胞菌与AMH呈显著负相关，与FSH、LH呈显著正相关，被认为在发病机制中起重要作用。例如，阴道扇胞菌与细菌性阴道病(BV)密切相关，在不同的群体中独立存在，并与BV中的生物膜密切相关。此外，微生物组成随着月经周期的时间而变化，因此一些标记物并不总是与以往的研究一致。未来还需要开展更多样本量更大、月经周期更细致的研究。

怀孕和未怀孕阴道微生物群比较

阴道部位的主要细菌为乳杆菌属，以产生乳酸而闻名，乳酸有助于维持阴道内的酸性pH值，作为抵抗病原体的屏障。先前的研究发现，阴道微生物群异常与生殖结果不佳存在关联。这表明阴道微生物组分析有助于在开始IVF或IVF- ICSI治疗前对怀孕机会进行分层；另一项研究未发现妊娠率和微生物组组成之间存在统计学上的显著差异。在乳杆菌中，乳杆菌是一种真正的阴道共生体。许多研究报道了阴道内存在的卷曲乳杆菌与健康状况之间的关联。在这里，我们发现CST I‐A和CST III‐A中极高的惰性乳杆菌和卷曲乳杆菌丰度(高于~90%)可能对IVF结果不利(分别为44.81%和51.06%)。阴道内的乳杆菌产生两种乳酸对映体(L-乳酸和D-乳酸)目前尚不清楚。由于惰性乳杆菌产生L‐乳酸，其在阴道微生物群中的优势与阴道pH值<4.5有关。研究发现，与含有惰性乳杆菌的样品相比，含有卷曲乳杆菌的样品中的乳酸水平更高。最近的研究表明，在肿瘤微环境中，乳酸菌可以改变肿瘤代谢和乳酸信号通路，可能有助于治疗耐药性的发展。此外，L. iners菌株的基因组成包括内溶素，这是一种形成孔的毒素，与G. vaginalis中的阴道溶素有相似之处。这些乳酸菌的负面影响和积累的毒素可能是治疗癌症类型和不良IVF结果的靶点。

值得注意的是，IV‐B型患者的妊娠率(48.09%)与I‐A型(44.81%)和III‐A型(51.07%)相当。这一发现令人惊讶，因为该群落类型以加德纳菌属和阴道菌属为主(61.38%)。最近的一项研究发现，一些女性阴道菌群中乳杆菌不占优势，甚至不存在，但这些女性没有报告BV的症状。这便对CST IV‐B的正常妊娠率作出合理解释。此外，一项对12项IVF研究的综合分析得出结论，细菌性阴道病(BV)对活产率没有显著影响。

结  论

总之，先前的研究表明，在接受辅助生殖的不孕妇女中，女性生殖道的微生物组组成与生殖结果之间存在关联。我们的目的是确定阴道微生物群组成是否与5种指定的群落类型、11种生理生化指标及其IVF生殖结局相关。我们使用16S rRNA基因测序分析1411名不孕症患者的阴道样本，其中1255名接受辅助生殖治疗。结果表明，过高或过低的乳杆菌丰度都会对生殖健康产生负面影响，这表明中等水平的乳杆菌(惰性乳杆菌和卷曲乳杆菌)对IVF结果有益。这些发现可能有助于制定预测阴道微生物群以控制IVF结果的策略。

方  法

患者和样本

在这项研究中，共有1411名被诊断为不孕症的患者(不孕症的定义是在一年内无保护措施的性行为后没有怀孕)。每个患者收集详细的医疗信息包括：年龄、身高、体重和BMI。诊断包括子宫内膜异位症、输卵管因素、排卵障碍、不明原因不孕症和/或男性因素等。下列类型的个体没有纳入本研究，在样本采集前一个月内服用过抗生素；甲状腺机能亢进、糖尿病、甲状腺功能减退、高泌乳素血症等内分泌失调失控者；目前有性传播或感染性疾病；抗逆转录病毒治疗史；精神疾病；子宫畸形；遗传性疾病；吸烟；饮酒；妇科恶性肿瘤；以及影响孕产妇健康的严重全身性疾病。其中，被诊断为男性因素导致不孕的180人作为本研究的对照组。所有阴道样本均于自然月经周期第2-3天(2022年1月至2022年6月)进行镜检时取自后穹窿。样品立即在- 80°C冷冻，待进一步使用。从2022年7月到2023年5月，对34例IVF/ICSI≥3次未怀孕的患者进行进一步的宏基因组测序。同时，随机选取第一次IVF/ICSI周期怀孕的患者37例作为对照。

生化测量

在自然月经周期第2-3天，禁食12小时后，在上午8点至9点采集静脉血样本。用化学发光免疫分析法COULTER DXI 800 (Beckman)测定血清激素水平，如FSH、LH、PRL、E2、总睾酮(TT)、AMH和P。

生殖结局分析

在1411例患者中，1255例在第一个IVF/ICSI周期中接受新鲜(冷冻)卵裂期(第3天)或囊胚期(第5天)胚胎移植(ET)。所有患者均为首次ET治疗。ET治疗后，研究记录生化妊娠率(第14天hCG阳性)和临床妊娠率(妊娠7周超声证实的胎儿心跳)。实现临床妊娠的患者被分配到妊娠组，而其他患者被分配到每个不孕症组的非妊娠组。

微生物基因组DNA提取，16S rRNA扩增子和测序

从阴道拭子(n = 1411)和非模板阴性对照中提取基因组DNA，以解决潜在的环境微生物DNA污染(n = 25)。按照制造商的说明，使用Ezup口腔拭子基因组DNA提取试剂盒(Sangon Biotech)进行总微生物基因组DNA提取。采用通用引物341F: CCTACGGGNGGCWGCAG扩增细菌16S rRNA的V3-V4高变区；805r: GACTACHVGGGTATCTAATCC。16S核糖体RNA基因在Sangon Biotech有限公司使用Illumina MiSeq平台测序，产生300-bp的对端reads。

16S rRNA - seq数据处理，去噪，物种注释

首先对测序获得的原始数据进行高质量过滤:去除PhiX序列，使用QIIME2软件和EasyAmplicon连接Q评分≥20的成对末端reads。使用DADA2降噪后产生的每个去重复序列称为ASV(扩增子序列变体)，对应于OTU代表序列。采用QIIME2的classification‐sklearn算法，使用预训练的朴素贝叶斯分类对每个ASV进行物种注释。根据ASV注释和每个样本的特征表，得到界、门、纲、目、科、属、种等层次的分类群丰度表。当考虑到我们的队列中至少5%的个体存在的分类群时，剩下16/35(剩余/总数)门，22/28纲，52/137目，91/215科，154/446属和322/1550 ASV。未定植于人类或与污染物相关的属从进一步分析中去除。在我们对阴道16S rRNA谱的研究中，我们采用一种简单的统计方法来识别和去除标记基因和宏基因组数据中的潜在污染物序列。随后，我们对每个分类单元的丰度进行了分析，从而将低丰度物种从进一步的考虑中剔除。我们保留在至少15%的样本中出现或丰度高于1%的分类群。为了获得特定的种，基于BLASTn搜索ASV对物种进行注释。使用VALENCIA鉴定CSTs。

Alpha和beta多样性

Alpha多样性表示在一个典型地区或生态系统中存在的物种数量。本文使用QIIME2软件，基于Shannon指数计算的归一化ASV丰度，利用alpha多样性分析样本物种丰富度和多样性的复杂性。对所有1411个样本在属水平上的相对丰度谱进行主坐标分析(PCoA)。维度排序提供群落样本沿坐标轴的位置值和离轴的距离。数据通过ImageGP进行可视化处理。

共发生分析

对于共现网络分析，基于每个属的相对丰度计算CST I‐A、I‐B、III‐A、III‐B和IV‐B中的细菌相关性，使用SparCC和100个bootstrap值来估计P值。保留P < 0.05的相关值。使用Gephi软件(https://gephi.org/)对5种阴道微生物群落的共发生网络进行可视化。计算节点的接近度和特征向量，以测量每个网络中的节点中心性。

组间变异分析

利用“线性判别分析(LDA)评分 > 4”参数，利用LEfSe发现高维生物标志物，以确定丰度特征和相关类别(如基因、代谢物或分类群)。LEfSe(线性判别分析效应大小)通过将统计显著性的标准测试与编码生物一致性和效应相关性的附加测试相结合，确定最有可能解释类别之间差异的不同特征(如ASV、属或基因)。

生理生化指标相关的微生物组组成的鉴定

然后将1411名个体的年龄、身高、体重、体重指数和7种激素水平与微生物组组成进行比较。使用R包(4.1.2版)计算11个因素与每种微生物在属和种水平上的丰度之间的Spearman’s r，并使用Benjamini-Hochberg方法调整P值。

宏基因组测序

其中71份阴道分泌物样本被用于宏基因组测序。在进行文库质量控制后，根据其有效浓度和所需数据量对不同文库进行汇总。每个文库的5′端被磷酸化和环化。随后，进行环扩增以生成DNA纳米球。最后，将这些DNA纳米球装入DNBSEQ‐T7测序仪，由Novogene Bioinformatics Technology Co., Ltd.进行测序。

宏基因组数据分析

数据质量控制过程包括去除低质量reads，包括(a)任何一个read含有接头污染，(b)超过10%的碱基是不确定的，以及(c)低质量碱基(Phred质量<5)的比例超过50%的reads。使用Fastp(版本0.23.1)进行此过程以获得高质量的数据。通过QC的样品最初使用MEGAHIT (v1.0.4)(‐‐presets meta‐large)进行组装，并使用SOAP denovo进行组装分析。使用Bowtie2 (Version: 2.2.4)将所有样本的高质量数据映射到组装好的scaffold上，并收集未利用的PE reads。长度在500bp以上的有效scaffold可用于进一步分析和基因预测。使用MetaGeneMark (Version 2.10)将这些scaffold用于开放阅读框(ORF)预测。

对长度小于100个核苷酸的ORF进行修整。随后，使用CD‐HIT对ORF进行去重复，以生成基因目录。在这种情况下，编码核酸序列的非冗余连续基因被称为基因。默认去重复参数:同一性= 95%，覆盖率= 90%。选择最长的基因作为代表基因，也称为单基因。CD‐HIT参数:‐c 0.95，‐G 0，‐aS 0.9，‐G 1，‐d 0;使用Bowtie2将高质量数据映射到基因目录中，参数: ‐‐ end ‐ to ‐ end, ‐‐ sensitive, ‐ I 200,‐ X 400。基因丰度是根据总测序数和基因长度来确定的。利用基因目录的丰度进行下游分析。随后，我们利用与数据库序列(microNR数据库)的序列或系统发育相似性对每个宏基因组同源物(MEGAN)进行分类注释。不同分类等级的丰度表以基因丰度表为基础。在对数据进行质量控制之后，我们总共获得了5.12 Tb(Tb)的高质量数据(平均每个样本约72.42 Gb)。随后，为了减少来自宿主的潜在DNA污染，我们将序列数据比对到人类基因组，并为后续分析保留了364.31 Gb(每个样本平均深度约5.20 Gb)的序列数据。

功能注释

一个群落的功能多样性是通过用功能注释宏基因组序列来量化的，这需要至少一个得分超过60 bits的高分片段对(High - score Segment Pair, HSP)。蛋白质编码序列被比对到功能数据库(包括KEGG、进化谱系)、非监督的同源群(NOG，版本:5.0)和碳水化合物-活性酶数据库(CAZy，版本:2023.03)进行功能注释。

ARGs分析

CARD(抗生素综合研究数据库)数据库被用于抗生素耐药基因的鉴定和表征。针对CARD数据库(Blastp, e‐value≤1e−5)对所有独特基因进行注释。每个基因或类型都有全面的信息注释，包括抗性谱和ARO机制。

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“iMeta” 是由威立、肠菌分会和本领域数百千华人科学家合作出版的开放获取期刊，主编由中科院微生物所刘双江研究员和荷兰格罗宁根大学傅静远教授担任。目的是发表所有领域高影响力的研究、方法和综述，重点关注微生物组、生物信息、大数据和多组学等。目标是发表前10%(IF > 20)的高影响力论文。期刊特色包括视频投稿、可重复分析、图片打磨、青年编委、前3年免出版费、50万用户的社交媒体宣传等。2022年2月正式创刊发行！发行后相继被Google Scholar、ESCI、PubMed、DOAJ、Scopus等数据库收录！2024年6月获得首个影响因子23.7，位列全球SCI期刊前千分之五(107/21848)，微生物学科2/161，仅低于Nature Reviews，同学科研究类期刊全球第一，中国大陆11/514！

“iMetaOmics” 是“iMeta” 子刊，主编由中国科学院北京生命科学研究院赵方庆研究员和香港中文大学于君教授担任，是定位IF>10的高水平综合期刊，欢迎投稿！