iMeta | SIDERITE：全面揭示化学空间隐藏的铁载体

SIDERITE：全面揭示化学空间隐藏的铁载体

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引  言

铁载体（Siderophore）是一类多样的次级代谢产物，表现出极强的螯合铁能力。而铁是参与细胞复制和呼吸作用必不可少的元素之一。铁载体在微生物生存和生长中具重要的作用。铁载体合成和摄取的相关途径广泛存在于微生物中，参与了微生物群落中的复杂生态博弈。作为一种特殊的天然产物，铁载体表现出显著的抗菌和抗真菌活性，使它们成为新型药物研发的热点。尽管它们很重要，但由于其多样性，当前我们对铁载体的理解仍然有限。

在过去几十年里，由于无数研究人员的努力，铁载体的系统分析取得了显著进展。2010年，Robert C. Hider和Xiaole Kong在一篇开创性的综述中提供了一份有价值的铁载体资源，附录中包括了294种铁载体的结构特征。根据2014年的一篇综述，当时研究者们已经鉴定出了500多种不同类型的铁载体，其中有270种已经进行了结构表征。唯一的铁载体数据库（http://bertrandsamuel.free.fr/siderophore_base/index.php）最后更新于2013年，目前已不再维护。此外，近些年新的铁载体分子甚至是新的铁载体功能基团类型，不断在各种微生物中被发现。而关于这些铁载体的信息目前分散在一篇篇文献中，需要系统记录。

实现对铁载体的系统概述的另一个重要挑战是缺乏数字化，这妨碍了计算研究。在天然产物领域，像集合开放天然产物（collection of open natural products， COCONUT）这样大型的数字化数据库记录它们的分子常采用SMILES（Simplified Molecular Input Line Entry System）格式。SMILES是存储和分析化学分子的常用格式，它将化学结构转换为一个字符串，易于计算机软件读取。这种格式使得机器学习等大规模计算研究成为可能。然而，目前还没有系统构建的数字化铁载体数据集。现有的数字化天然产物数据库尚不能以“铁载体”关键词进行公开搜索，且收录的铁载体只包含当前已知铁载体的一小部分。

总之，建立一个综合的铁载体数据库对于深入了解铁载体的合成、功能和应用至关重要。为了满足这一需求，我们开发了铁载体信息数据库（Siderophore Information Database, SIDERTIE）。这是一个用户友好的平台，以SMILES格式收录了截至2023年5月所有已知的铁载体，共包含了872条记录和649种独特的结构。利用SIDERTIE的数字化特性，我们得到了迄今为止最全面的铁载体信息统计数据，涵盖了生物合成途径、产生者来源和化学特性。已知的铁载体在天然产物的化学空间中分散分布，这暗示了铁载体结构广阔的多样性范围，而其大部分空间还没有被充分探索。基于数据库中已知的铁载体结构，我们提出了一种基于功能基团的方法来批量发现新的铁载体，并进行了实验证实。

结  果

SIDERITE概述

铁载体信息数据库（SIDERITE，http://siderite.bdainformatics.org）包含了872条记录，涵盖了截至2023年5月已知的所有铁载体。除了来自先前数据库和综述的铁载体记录外，还有224条记录是首次从单篇研究文章中手动获取的（表S1）。除了扩展的数据集外，SIDERITE以SMILES格式记录了铁载体结构。与其他铁载体数据集相比，SIDERITE拥有最庞大的铁载体记录，并且因为可以免费访问和数字化而脱颖而出（表S2）。铁载体的数字化使得计算分析成为可能，特别是可以根据其化学结构统一分析铁载体。通过比较铁载体的规范化SMILES，我们在总共872条记录中确定了649种结构唯一的铁载体（表S3）。在这个过程中，我们观察到许多铁载体具有相同的结构但具有不同的名称，例如bacillibactin和corynebactin。这一观察表明这些相同的铁载体在不同物种中或被不同研究小组重复发现。因此，对于每个独特的铁载体结构，我们合并了相应的记录，并将其中一个名称指定为正式的“铁载体名称”，同时将其他名称记录为“铁载体其他名称”。将铁载体数字化还使其统计分析成为可能（图S1）。

铁载体的结构相似性聚类

已知铁载体表现出显著的结构多样性（图S2）。将铁载体转换为SMILES格式使我们能够更有效地量化它们在SIDERITE数据库内以及与其他天然产物之间的化学相似性。为了系统评估铁载体的结构多样性，我们首先将SIDERITE数据库中的所有649个结构定位到COCONUT数据库的广阔化学空间中，合并这两个数据库中的所有分子，其中包括超过4 × 10⁵ 种天然产物。通过化学相似性的Tree MAP（TMAP）进行可视化（图S3），我们观察到这649个铁载体可以分为25个不同的簇（cluster），它们被COCONUT中的天然产物分隔开。聚类结果显示，铁载体的结构多样性分布不均匀（图1和表S3）。这些簇中大多数（25个中的16个）仅包含少量成员（<5），而最大的四个簇占总铁载体结构的89.37%。我们按成员数量将簇索引按降序排序；例如，簇1包含最多的铁载体结构。

在每个簇内，都有功能基团或生物合成类型的共同特征。簇1（201，30.97%）包括由非核糖体肽合成酶（non-ribosomal peptide synthetase, NRPS）合成的铁载体和NRPS无关的铁载体（NRPS-independent siderophore, NIS），其中功能基团中含有苯环结构（例如，儿茶酚，酚）。簇2（197，30.35%）仅包括由NRPS产生的铁载体。簇2中的大多数铁载体含有异羟肟酸（92.39%，182/197）和α-羟基羧酸（37.06%，73/197）。簇3（103，15.87%）完全由NIS铁载体组成。与聚类2类似，其中大多数铁载体含有异羟肟酸（90.29%，93/103），并且许多还含有α-羟基羧酸（33.01%，34/103）。簇4（79，12.17%）是具有发色基团（例如pyoverdine）的NRPS铁载体（93.67%，74/79）。其他小的簇都位于四个大的聚类群边缘（图1A）。它们由类似的功能基团组成（图S4-S16），这表明可能会从常见铁载体中演化出不寻常的铁载体。

图1. SIDERITE中25个铁载体簇的可视化

（A）由化学相似性连接的铁载体网络。网络中的每个节点对应一个铁载体分子，节点与其最相似的邻居相连，形成最小生成树（见“方法”部分）。节点根据其簇的索引进行上色。（B）对于四个最大的簇，提供了示例结构，并且对铁载体的功能基团进行了颜色标注。铁载体用圆角矩形圈出，以显示它们的簇（与（B）中的配色相同）。

按簇和组命名铁载体

对于铁载体，簇仅提供了相对于其他天然产物分子的初始分类。此外，我们根据它们的结构相似性系数，在每个簇内部定义了组（Group），共计得到了102个组。每个组由其所在簇的索引x 和该簇中的组索引 y 命名。因此，每个铁载体被分配一个唯一的索引 x.y.z，其中z代表这个铁载体是该组内的第z条记录。在将来，新发现的铁载体被纳入SIDERITE数据库时也将被分配一个唯一的索引。

对于生物合成类型未知的铁载体，它们的生物合成类型可以通过同一组中已知生物合成类型的其他成员来推断，因为同一组中几乎所有成员都具有相同的生物合成类型（除了1.5和1.10）。这对发现新的铁载体后在基因组中挖掘其生物合成基因非常有用，将加速从结构到基因的铁载体研究。

用基于功能基团的方法发现潜在的铁载体

已知铁载体的聚类分析揭示了这些化合物中常见功能基团的存在。受到这一观察的启发，我们提出了一种基于规则的方法，旨在通过化学结构发现新的铁载体（图2A-C）。在这种方法中，我们首先从已知铁载体的特征中提炼出了15种常见的功能基团。在规则中，任何含有至少一种这15种功能基团的分子都被确定为潜在的铁载体（图2D和表S4）。然后，我们排除了含有任何8种被修饰铁载体功能基团的候选物（图2E和表S5），因为被修饰的铁载体功能基团无法形成配位键以螯合铁。此外，虽然α-羟基羧酸功能基团在铁载体中普遍存在（图2F），但由于它在非铁载体分子中也普遍存在，我们将其从我们的规则集中排除。

为了验证这种方法，我们将基于功能基团的方法应用于大型化学数据库COCONUT中（排除了数据库中已知的322种铁载体）。我们在这一具有超过40万天然产物的数据库中识别出了3199种具有潜在的铁结合活性的分子（表S2、S6）。通过Tanimoto相似性聚类（图2C），这些潜在的铁结合分子中有很大一部分散布在化学空间中，并不接近任何已知的铁载体。具体而言，在3199种分子中仅有284种显示出与SIDERITE中记录的649种已知铁载体有明显的结构相似性（以Tanimoto相似性> 60%位结构相似的判断标准）。剩余的2915种分子则是未探索化学结构的新型铁载体的强有力候选。这项分析强调了铁载体的结构多样性在很大程度上仍未被发现，需要进一步深入探索和研究。

用CAS试验验证潜在的铁载体

随后，我们从3199个候选物中搜索可购买的分子进行实验验证。48种分子（表S7和图2B）可在商业天然产物库中获得（高通量筛选天然产物库，目录号L6000，TargetMol，中国上海，2023年6月）。在这些分子中，22种可溶于水，而剩下的26种溶解性较差（见表S7）。为了解决这个问题，对于溶解性较差的分子我们使用二甲基亚砜（DMSO）作为溶剂。随后，通过铬天青S（chrome azurol S， CAS）测试了这48种分子的溶液。CAS测定是一种通用的色度法，用于检测分子是否能结合铁。

CAS测定的高阳性率支持了我们基于功能基团的方法的有效性。在测试的分子中，22种水溶性化合物中有20种（90.9%），26种水不溶性化合物中有20种（76.9%）显示出结合铁的活性，这表现为CAS染料颜色的明显变化（图2G、H和表S8）。实际上，大多数CAS结果为阴性的分子（化合物20、24、31、33、37、41和44）显示出异常的颜色模式，这影响了准确评估。例如，它们的原始溶液颜色明显深或与CAS试剂反应形成沉淀或混浊。实际上，化合物24、37、41和44在CAS测定溶液中确实引起了颜色变化，但它们的沉淀干扰了光密度测量。总的来说，48种分子中只有一种（化合物13）被确认一定缺乏螯合铁的能力。

图2.基于规则的铁载体发现方法和铬天青S（CAS）测试实验结果

（A）基于规则的铁载体发现方法的原理。这些规则是根据SIDERITE数据库中已知的铁载体总结的。然后通过实验进行验证。（B）基于功能基团的铁载体发现流程。含有（D）中的至少一个功能基团且不含（E）中的任何一个修饰功能基团的分子被选择为铁载体候选物。（C）在开放天然产物（COCONUT）数据库中新潜在铁载体的结构多样性。具有潜在铁结合活性的3,199个分子和已知的649个铁载体根据Tanimoto相似性进行了聚类。分子来源（COCONUT或SIDERITE）通过左侧条形图以黄色和黑色表示。（D）（B）中规则中的铁载体功能基团的结构。功能基团的稀有程度由不同的背景颜色表示。（E）（B）中规则中修改的功能基团的结构。导致功能基团失去螯合铁能力的修饰以红色标记。（F）常见功能基团α-羟基羧酸的结构。（G）25种水溶性铁载体候选物的CAS结果。溶剂为水。柱状图中显示了光密度（OD，630nm）的平均值和±一个标准偏差。溶剂的OD（630nm）标记为红色线（平均值）和红色虚线（一个标准偏差）。CAS测试中结果为阴性的化合物标记为红色。（H）30种水不溶性铁载体候选物的CAS结果。溶剂为二甲基亚砜（DMSO）。其他图例与（F）相同。（I）具有铁结合活性的代表性化合物示例。

方  法

铁载体信息资源

我们共收集了872条铁载体信息记录。其中，有355条记录来自Samuel Bertrand的铁载体数据库，其余记录则来自其他数据库、综述和研究文章（表S1）。具体来说，我们从Robert C. Hider和Xiaole Kong的综述附录中获取了160条新记录，从其他综述获取了37条新记录，从天然产物词典（Dictionary of Natural Products， DNP）数据库（https://dnp.chemnetbase.com/）获取了95条新记录，并通过关键词搜索（如“new siderophore”，“novel siderophore”和“siderophore discovery”）从研究文章中获取了224条新记录。需要注意的是，我们从LOTUS数据库中使用关键词“pyoverdine”获取了一条新记录，该记录属于pyoverdine铁载体的一种。这是因为该数据库仅允许通过其特定名称（如“pyoverdine”）而不是通过一般的生物学功能（如“铁载体”）来搜索铁载体。

我们数据集中的每个铁载体信息记录都包括各种详细信息，包括铁载体名称、同义名称（如果有）、功能基团的类型和数量、产生物种、生物合成类型和结构（表S1）。

生物合成类型注释

我们的数据库中提供了721种铁载体生物合成类型的信息，这是基于文献记录的。对于其余的151种具有未知生物合成类型的铁载体，我们通过不同的特征来推断它们的生物合成类型。如果铁载体包含仅存在于NIS铁载体中的单体，例如柠檬酸、二胺（如1,3-二氨基丙烷、腐胺和尸胺）或二胺衍生物（如N-羟基腐胺），则将其生物合成类型标注为“推测的NIS”。如果该铁载体中的单体都是氨基酸，则将其生物合成类型标注为“推测的NRPS”。

从铁载体转换为SMILES

简化的分子输入线条式（Simplified Molecular-Input Line-Entry System， SMILES）是一种描述分子化学结构的符号表示法，使用字符串格式尤其适用于计算机的后续处理。然而，在我们的铁载体信息资源中，铁载体结构及其注释的SMILES格式仅在DNP数据库中提供。相反，文献和铁载体数据库仅包含铁载体结构的图片格式，对读者来说更直观，但对于计算分析来说存在困难。为解决此限制，我们写了一个自定义的Python脚本，利用ChemSpider API和化学标识符解析器（CIR）将铁载体名称转换为SMILES格式。在铁载体数据库中，检索了34.93%（124/355）的铁载体记录的SMILES格式结构。对于未找到的其他资源的剩余748个铁载体，我们手动绘制了它们的结构，并通过SMILES生成器/检查器工具（http://www.cheminfo.org/flavor/malaria/Utilities/SMILES_generator___checker/index.html）获得了SMILES格式结构。

为确保一致性并便于比较，我们也使用了另一个自定义的Python脚本将所有SMILES字符串转换为规范化的SMILES字符串。这个转换过程使用了RDKit软件包，同时获取了铁载体的分子式和分子量。

基于SMILES的铁载体的水溶性和扩散系数预测

为了预测水溶性，我们使用了一个名为SolTranNet的机器学习工具，以铁载体的SMILES作为输入。对于扩散系数的预测，我们使用了由Evans等人开发的SEGWE计算器，温度为298.15K，溶剂为水。

铁载体在化学空间中的可视化分布

为了直观地比较和分析铁载体，我们利用TMAP将SIDERITE与其他化学数据库进行可视化。SIDERITE与其他化学数据库的可视化映射包括用于探索新铁载体的广阔化学空间。TMAP映射算法倾向于在具有和不具有立体异构体规范化的分子之间产生显著距离。为了避免这种偏见，我们根据规范的SMILES去除了立体异构信息。在可视化中，SIDERITE与其他化学数据库的交集被从化学数据库中去除。

铁载体的聚类

铁载体聚类的确定基于它们在化学空间中的分布。化学空间由众多分子组成，在我们的研究中，我们使用了COCONUT数据库，该数据库包含约40.7万个小分子。在这个空间中，铁载体被其他非铁载体分子分隔开，分成了不同的簇。

为了在每个铁载体簇（cluster）中识别组（group），我们用了60%的分子结构相似性作为阈值。具体来说，如果铁载体的分子相似性大于60%，则认为它们属于同一组。相似度用的是Dice系数（Dc）。

通过CAS实验测试结合铁的活性

我们使用基于功能基团铁载体发现方法，从COCONUT天然产物数据库中发现了3199个潜在的铁载体。其中48种可以从商业天然产物库中购买。随后，我们采购了这些小分子（见表S7），进行铁结合能力的验证。然后，将这些小分子溶解在灭菌去离子水或二甲基亚砜（DMSO）溶剂中，终浓度为1mg/ml。通过CAS检测实验评估小分子的铁结合活性。简而言之，将100ul的CAS检测液和100ul的小分子溶液在96孔板中1:1混合，用灭菌去离子水或二甲基亚砜（DMSO）溶剂作对照，每个处理四个重复。室温下静置反应2h时后使用SpectraMax M5酶标仪测定OD630的吸光度。最终通过比较处理和对照的吸光度判断小分子的铁结合活性。

讨  论

在我们的工作中，我们建立了迄今为止最全面的铁载体信息数据库（SIDERTE，https://siderite.bdainformatics.org/），这是第一个采用SMILES格式具有649种独特结构的数字化铁载体存储库。这个数字化的存储库使研究人员能够克服手动方法的局限，为铁载体领域数据驱动的发现铺平了道路。基于这些数字化结构，我们开发了一种计算方法，用于发现具有高准确度的新型结合铁分子，并发现在铁载体研究领域中尚未完全探索的结构多样性。SIDERTE为新型铁载体的发现提供了一个存储库。我们在数据库或GitHub页面提供了教程材料和反馈渠道（详见补充资料），并承诺持续维护SIDERTE数据库，并根据用户的反馈进行更新。

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“iMeta” 是由威立、肠菌分会和本领域数百千华人科学家合作出版的开放获取期刊，主编由中科院微生物所刘双江研究员和荷兰格罗宁根大学傅静远教授担任。目的是发表所有领域高影响力的研究、方法和综述，重点关注微生物组、生物信息、大数据和多组学等。目标是发表前10%(IF > 20)的高影响力论文。期刊特色包括视频投稿、可重复分析、图片打磨、青年编委、前3年免出版费、50万用户的社交媒体宣传等。2022年2月正式创刊发行！发行后相继被Google Scholar、ESCI、PubMed、DOAJ、Scopus等数据库收录！2024年6月获得首个影响因子23.8，位列全球SCI期刊前千分之五(107/21848)，微生物学科2/161，仅低于Nature Reviews，同学科研究类期刊全球第一，中国大陆11/514！

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