摘 要
细胞皮肤替代物已被开发用于多种场景，如伤口愈合和皮肤再生。这些细胞模型大多是角质细胞和成纤维细胞等原代细胞堆叠的二维（2D）结构，未来需要进一步开发三维（3D）培养的器官组织，这样能够深入了解体内表皮的表型和生理。本文报告了表皮类器官（epidermal organoids，EpiOs）【由诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）生成】，其作为一种新型表皮构建体的发展，以及其作为由细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）回收的分泌型生物大分子来源的应用。分化的 iPSC 表皮器官组织（iPSC-derived epidermal organoids，iEpiOs）能通过多个器官组织培养和扩增，同时保留与体内表皮相似的分子和功能特征，这些成熟的iEpiOs含有表皮干细胞群，并进一步分化成其他皮肤，如毛囊干细胞。研究发现，iEpiOs 能产生高性能的 EVs，其含有高水平的血管生成生长因子 VEGF 和 miRNAs，能调节细胞的增殖、迁移、分化和血管生成等过程，为体内伤口愈合提供了一种很有前景的治疗工具。总之，新开发的 iEpiOs 作为一种基于类器官的方法，为皮肤基础研究和转化研究提供了一个强大的模型，未来还可能利用 iEpiOs 分泌的 EVs 开发出相应的治疗方案、产品。（公众号只选取部分内容进行翻译解读，详细内容见附件原文）。
一、背景介绍
表皮是防止水分流失、物理损伤和化学损伤的屏障，具有很强的再生能力，这是因为表皮干细胞位于表皮基底层，具有自我增殖或向外分化形成皮肤屏障的能力。以往对原代角质细胞或诱导多能干细胞（iPSCs）分化的角质细胞其与肿瘤发生、炎症和屏障功能有关的表皮干细胞生物学的研究主要通过二维（2D）培养方式来进行。这种方法在原代细胞的培养中有许多优点，但也存在部分局限性，如体外维持受限、难以再现体内细胞组成和人体表皮的生理结构，以及不同供体的再现性不同等。另外，角质细胞也可通过跨孔气液相（air-liquid interphase，ALI）培养法重建为功能性人体表皮等效物，用以模拟人体皮肤的生理结构，但这种重建的三维（3D）表皮等效物也存在难以维持的问题，因此需要一种更加方便培养的模型。
为了克服这些困难，人们开发了类器官模型来扩增成年小鼠和人类表皮细胞，并将其终极分化为表皮细胞层。然而，由多能干细胞直接培养出的可在体外稳定培养的表皮器官组织尚未见报道。
随着组织工程学在类器官开发方面的最新进展，人们尝试建立包含各种细胞类型的体外三维培养类器官模型，以克服培养二维原代细胞的缺点。与二维培养细胞相比，三维培养的类器官系统有许多优点：(i ) 可保持体内表型和功能；(ii) 可长期增殖；(iii) 可自我组装并重现体内结构。此外，三维培养的器官组织来源于多能干细胞或组织干细胞，可自我组织成与生理结构相似的多细胞结构，但是三维培养的细胞无法复制器官中错综复杂的多细胞合作。因此，有必要开发模拟体内组织的类器官模型，并将其本身及其副产品（如细胞外囊泡（EVs））用作生物材料，以反映其多细胞来源。
细胞外囊泡是一种释放到细胞微环境中的脂质结合囊泡，可转移多种分子，如核酸、、脂质以及代谢物。EVs 还携带蛋白质，如表面蛋白，包括整合素、四跨蛋白（如 CD9、CD63 和 CD81）和粘附分子，以及细胞膜蛋白（如 Tsg101 和 Alix）。这些蛋白/分子取决于 EVs 的生成方式和分泌的细胞类型，同时使得它们在生理和病理过程中发挥不同的作用。近几年，三维培养系统已成为分泌能够增强其功能特性和治疗效果的外泌体模型。
在本研究中，团队建立了由 iPSCs 分化而成的表皮类器官（EpiOs），它能释放功能性 EVs，这些iEpiOs由表皮干细胞组成的基底表皮细胞层和分化的表皮细胞层（包括棘层、颗粒层和粟粒层）组成，其与体内表皮形态非常相似。团队利用 RNA 测序技术研究了维持 iEpiO 特性和发育分化表皮层的机制。此外，三维培养的 iEpiOs 能够产生功能性 EVs，其中含有的生物大分子具有更强的再生能力，有助于未来治疗方法的开发。因此，该研究提供了一种来自造血干细胞的可扩展功能性表皮类器官，以及来自EpiOs的治疗基础。
二、结果
1、从 iPSC 生成的表皮器官组织并确定其特征
为了从 iPSCs 中建立表皮器官组织，团队对之前报道的方案做了一些修改（图 1a）。
（5）iPSC衍生的表皮器官组织（iEpiO）在分化第15天开始形成，内部有角质化核心；1周后，这些组织已长到约200微米大小（图1b）。
通过评估表皮基因（如ΔNp63、Krt5、Krt10、Krt14、Sox9、Itga6、Filaggrin (Flg) 和 Loricrin (Lor)）的表达，确认 iPSCs 在第 15 天分化为表皮器官组织（图 1c）。此外，免疫荧光还观察到成熟的 iEpiOs 中基底层标记物（ΔNp63、Sox9、Krt5 和 Krt14）、棘层标记物（Krt1 和 Krt10）、颗粒层标记物（Loricrin 和 Involucrin）和粟粒层标记物（Filaggrin）的高表达水平，这表明有机体具有多层表型（图 1d）。
图1. iPSC 衍生表皮器官组织的生成和特征描述
2、iPSC 和角质细胞衍生的表皮器官组织的相似特性
有研究利用从小鼠的表皮角质细胞成功得到了小鼠原代表皮器官组织。为了比较 iEpiOs 和原代表皮器官组织的特性，团队提取了成年小鼠表皮组织并建立了角质形成细胞衍生的表皮器官组织（keratinocyte-derived epidermal organoids ，kEpiOs）。与iEpiOs相似，成熟的kEpiOs也可以扩增，同时还能形成多层表皮结构和重建表皮等同物，这表明每个表皮类器官的功能特征是相似的。接下来，为了研究器官组织的增殖能力，将相同数量的 iEpiOs 和 kEpiOs 接种并培养 7 天，然后以 2 天为间隔比较它们的生长速度。结果发现iEpiOs 和 kEpiOs 的生长速度相似（图 2a），与 iPSCs 的表皮特异性标记表达水平相比，两种有机体都保持了相似的水平（图 2b）。后续，团队进行了集落形成效率（colony-forming efficiency，CFE）测定，证实两个有机体都含有表皮干细胞（图2d）。有趣的是，iEpiO衍生菌落的平均数量在第10阶段比kEpiO衍生菌落的平均数量多出约3倍（图2d），然而，在第 20 个阶段，没有观察到明显的差异（数据未显示），这表明长期培养可以富集 kEpiOs 的集落形成细胞。总之，这些数据表明，分化的iEpiOs与kEpiOs类似，可以经过多次传代，在体外表现出长期的表皮干细胞维持和扩增。
图2. 表皮组织显示出表皮干细胞的维持和分化能力
3、表皮类器官在三维培养条件下显示出分层结构的特征
为了进一步研究 iEpiOs 和 kEpiOs 的特征，团队将三维培养的类器官附着在二维细胞培养板上，生成并培养单层的表皮细胞。在二维细胞培养板上的细胞与在三维环境中生长的细胞形态明显不同，变得扁平且呈多边形（图3a），这表明在二维培养板上培养的类器官失去了分层表皮结构。此外，当三维和二维培养的细胞以相似的密度种下去并培养 7 天以比较其增殖能力时，三维培养的器官组织与二维培养的表皮细胞相比呈现指数式增长，两者相差约 8 倍（图 3b）。与这些结果一致的是，与三维培养的类器官相比，二维培养细胞中表皮分层表型的标记物，即基底层（ΔNp63）、棘层（Krt1 和 Krt10）、颗粒层（Involucrin 和 Loricrin）和粟粒层（Filaggrin）的标记物明显减少（图 3c-e）。另一方面，已知在二维培养的原代角质形成细胞中含量丰富的 Sox9、Krt5 和 Krt14 的表达则保持不变，与二维或三维培养方法无关（图 3c-e）。后续，团队针对组蛋白 3 赖氨酸 4 三甲基化（H3K4me3）进行了染色质免疫沉淀检测，以确认代表性标记在表观遗传水平上的激活。结果发现，在三维培养的 iEpiOs 细胞中，p63、Flg 和 Lor 的启动子区域的 H3K4me3 比二维培养的细胞明显富集（图 3f）。总之，这些结果表明，在三维培养的表皮器官组织中，与表皮特异性分层结构相关的基因被上调，这可能会产生致力于表皮系的多层细胞。
图3. 二维培养表皮组织的建立和表征
4、基于培养方法对表皮器官组织转录组进行比较（在本文只做简单描述，如有需要可见附件原文）
(i) 3D和2D培养的类器官中AP-1转录因子的mRNA表达水平
图4. 二维和三维表皮器官组织的综合转录组分析
三、小结
在本研究中，团队用 iPSCs 培育可稳定扩增的表皮器官组织，用来模拟体内表皮的生理结构，并生成与体内功能类似的EVs。iPSC衍生的EpiOs可以：i) 自我更新；ii) 完全分化成分层表皮，包括基底层、棘层、颗粒层和角化层；iii) 容易扩增并保持多次传代；iv) 可长期冷冻保存，为皮肤研究提供新的三维平台。因此，这种类器官模型的好处在于它能够自我更新或分化成复杂的表皮层，与其在体内的形态非常相似，这表明我们的类器官可用于表皮稳态、再生和疾病的研究。尤其是，这项研究证明了有机体本身的实用性，以及从有机体中释放的EVs的有效功能。这些EVs含有功能性成分，能促进靶细胞的生长、迁移、血管生成和伤口愈合，因此对基础研究和转化研究很有价值。因此，iPSC衍生的EpiOs可能是了解皮肤发育和生理学及其治疗作用的一种有前途的模型。
翻译文稿不免出现笔误，还请各位读者指正和谅解！如有遗漏，欢迎留言补充。
排版丨壹 万
