摘 要
目前，临床上用于治疗骨关节炎和类风湿关节炎的效果存在局限，间充质干细胞（mesenchymal stem cells ，MSCs）被认为是一种前景广阔的再生疗法来源，但未经修饰或基因工程改造的间充质干细胞在体内注射后由于其药物疗效低和不可预知的副作用而被限制发展。本文展示了一种可以增强间充质干细胞向炎症关节迁移的方案，即通过间充质干细胞与负载三苯氧胺的纳米金柱共轭，并配合近红外激光辅助光热疗法（photothermal therapy ，PTT）来增强药物的抗炎效果。文章提出了：PTT 的免疫调节机制；PTT 下调白介素 22 受体（与关节炎发病机制有关）在 T 淋巴细胞中的表达，并抑制了 Th17 从幼稚 CD4 T 细胞的分化；间充质干细胞与三苯氧胺负载的金纳米棒（Edu-MSCs-AuS-TA）可促进巨噬细胞的极化，减少关节中性粒细胞的招募；Edu-MSCs-AuS-TA能明显减轻关节炎相关疼痛，改善一般运动活动；在关节炎模型的严重阶段也能诱导软骨再生等。（公众号只选取部分内容进行翻译解读，详细内容见附件原文）。
一、介绍
类风湿性关节炎（Rheumatoid arthritis ，RA）是一种全身性自身免疫性疾病，是由自身免疫耐受性丧失而引起关节慢性炎症，继而导致软骨和骨质破坏。在过去几十年中，RA 患者的治疗已取得了显著改善，但仍有相当一部分 RA 患者在使用药物后难以治愈。骨关节炎（osteoarthritis，OA）是常见的退行性关节疾病，会随着时间的推移而恶化，通常会导致慢性疼痛和僵硬，其中膝关节中保护骨骼末端的软骨会逐渐退化。目前还没有一种能够减轻症状的同时还可以停止疾病进展的药物或治疗方法获得监管机构的批准，只有缓解症状的药物，如治疗 OA 的镇痛药。因此，生物医学界致力于从组织重塑和修复方面解决关节炎的问题，但组织重塑并非由单一因素介导，而是由维持平衡的各种因素共同调控，科学家将研究方向转移到干细胞的开发中。
在干细胞中，间充质干细胞（mesenchymal stem cells ，MSCs）因其易于分离和制备，以及与生俱来的抗炎反应能力，被认为是用于治疗关节炎的发展方向。重要的是，间充质干细胞对炎症介质具有内在趋向性，可以被开发用于针对病理生理部位的靶向治疗，如OA和RA中的发炎关节。此外，间充质干细胞还能分泌免疫调节分子，包括吲哚胺 2,3-二氧化酶（indoleamine 2,3-dioxygenase ，IDO）、前列腺素 E2（prostaglandin E2，PGE2）、转化生长因子（transforming growth factor beta ，TGF-1）、白细胞介素-10（interleukin-10，IL-10）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factors ，VEGF）和表皮生长因子（epidermal growth factors， EGF）等，从而治疗关节炎。但是，将间充质干细胞作为治疗关节炎的思路还面临着各种挑战，例如间充质干细胞缺乏抗炎功效，而且向体内炎症部位迁移的能力有限。通过静脉注射的间充质干细胞会选择性地在肺部和肝脏处积聚（肝脏和脾脏中的巨噬细胞通常会清除给药的间充质干细胞），导致没有足够浓度的间充质干细胞被输送到目标组织，如发炎的关节。
金纳米粒子（gold nanoparticles ，AuNPs）是获美国食品药物管理局批准的金属纳米颗粒，其在药物输送、成像探针和治疗剂（包括热消融）中具有广泛的应用，主要是由于其晶体形态相对稳定、几乎不可腐蚀、与活性生物分子的反应性也很差，且金与硫配体之间的强键结合使硫化化合物能够在 AuNP 表面共轭，从而实现药物输送和组织的特异性靶向。利用近红外对组织内的 AuNPs 进行光激活可诱导纳米粒子加热，这不仅能更好地保存骨质，还能抑制关节炎模型中炎性滑膜侵袭、软骨侵蚀和促炎细胞因子的表达。
在本文中，作者利用炎症进行共培养，可以有效地将抗炎药物输送到炎症部位。这种培养方式在胶原诱导的关节炎（collagen-induced arthritis，CIA）模型中大大提高了间充质干细胞对炎症关节的靶向性，此外其他可以进行表征的细胞因子均在表达上发生了显著的变化，具体如实验结果所示。
二、实验结果
1、炎症介导的过程增强间充质干细胞对成纤维细胞样滑膜细胞和巨噬细胞的靶向能力（体外实验）
本研究设计了一种炎症介导的教育过程，用以增强间充质干细胞的迁移能力（图 1a），具体为：将脂多糖（lipopolysaccharide ，LPS）刺激的J774（巨噬细胞）和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor alpha ，TNF-α）刺激的成纤维细胞样滑膜细胞（fibroblast-like synoviocytes ，FLSs）共培养24小时后收集细胞因子，并用Naïve间充质干细胞处理24小时得到携带相关细胞因子的MSC；
为了确定教育后迁移能力最强的间充质干细胞，在体外分析脂肪组织间充质干细胞（adipose tissue-derived MSCs ，ADMSCs）、骨髓间充质干细胞（bone marrow-derived MSCs ，BMMSCs）和脐带间充质干细胞（umbilical cord-derived MSCs ，UCMSCs）的迁移能力，其中ADMSCs 对 FLS 或 J774 的迁移能力明显增强（图1b）；
由于 ADMSCs 向巨噬细胞和 FLSs 迁移的能力增强，因此后续实验都选择 ADMSCs 作为给药载体。后对间充质干细胞的教育机制以及增强和影响迁移能力的因素进行研究分析，发现类风湿滑膜分泌的趋化因子包括基质细胞衍生因子（stromal cell-derived factor ，SDF-1/CXCL12）、巨噬细胞炎症蛋白-1α（macrophage inflammatory protein-1α ，MIP-1α/CCL3）、单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1 ，MCP-1/CCL2）和正常T细胞表达和分泌的活化后调控因子（regulated upon activation normally T cell ，RANTES/CCL5），这些趋化因子可能会吸引间充质干细胞进入炎症关节（图 1d）。
利用抗体阻断趋化因子表面的受体，并分析它们对细胞迁移的抑制作用（图 1e），其中CCR2、CCR3和CXCR4显著影响FLS的迁移能力，CCR1和CCR2显著影响巨噬细胞的迁移能力；
利用反转录定量聚合酶链反应（RT qPCR）研究了间充质干细胞在教育过程中的变化，发现在炎症培养基的教育过程中，趋化因子受体的表达明显上调（图 1c）。
图1 炎症介导的教育过程增强了间充质干细胞靶向FLS 和巨噬细胞的能力
2、增强间充质干细胞对炎症关节的靶向能力（体内试验）
利用CIA模型评估受教育间充质干细胞的体内迁移能力（图2a）；
连续一周在CIA小鼠模型中静脉注射受教育间充质干细胞三次，并通过体内成像系统（in vivo imaging system ，IVIS）进行追踪分析。与Naïve间充质干细胞相比，受过教育的间充质干细胞对前爪、后爪和尾部发炎关节的靶向能力明显增强（图2b）；
此外，对后爪关节组织的组织学分析证实，受过教育的间充质干细胞具有更强的迁移能力（图 2c）。
图2 . 受过教育的间充质干细胞靶向发炎关节的能力
3、在间充质干细胞膜上合成并结合纳米药物
将PEG 化星形金纳米颗粒（AuS）与抗 CD90 抗体（anti-CD90 antibodies，Abs）和曲安西龙（Triamcinolone，TA）共轭。
将 AuS 与抗 CD90 抗体共价结合，同时与 TA 进行非共价结合，得到AuS-TA（图 3a）； 将 AuS-TA 与教育后的间充质干细胞（Edu-MSCs）共轭，得到Edu-MSCs-AuS-TA（图 3b）； 利用透射电子显微镜（TEM）和扫描电子显微镜（STEM）观察PEG 化金纳米棒-三苯氧胺复合物（AuS-TA）的星形形态，并确定PEG 化 AuS（AuS-PEG）和 AuS-TA 在形状和结构上的差异（图 3c）； 使用红外热像仪检测近红外激光照射下 AuS-TA 的光活化情况【在 5 分钟内用近红外激光将 AuS-TA升温至 15°C】（图 3d）； Edu-MSCs-AuS-TA 的共焦图像证实了 AuS-TA 与 Edu-MSCs 膜的成功结合（图 3e）； 此外，UV-vis光谱显示，AuS-TA 和 Edu-MSCs-AuS-TA 在 810 纳米（AuS）、260 纳米（MSC）和 242 纳米（TA）处出现吸光峰（图 3f、g）
图3. 纳米金柱（AuS）-三苯氧胺（TA）与 Edu-MSCs 的共轭
4、Edu-MSCs-AuS-TA 的内吞途径分析
纳米颗粒是通过内吞作用进入细胞中的，除内吞方式外还有细胞内转运途径，不同的途径选择与其理化性质有关。为了分析AuS-TA和Edu-MSCs-AuS-TA在FLS中的内吞方式，团队分别分析了内吞途径和细胞内转运途径。
a) AuS-TA 在OA和RA 患者来源的 FLS 中，其内吞途径分析和细胞内转运方案；
b) AuS-TA 在 FLS 中的内吞途径分析【用 20 ng mL-1 的 TNF-α 刺激 FLS，后用20μm 的 CPZ（clathrin 介导的内吞）、200μm的GEN（caveolin 介导的内吞）和25μm的EIPA（大蛋白内吞）抑制内吞途径】；
c) AuS-TA 在 FLS 中的胞内转运；
d) Edu-MSCs-AuSTA在FLS中的内吞途径分析和胞内转运方案，以及Edu-MSCs-AuS-TA将AuS-TA转移至FLS的共聚焦图像；
e) Edu-MSCs-AuS-TA 在 FLS 中的内吞途径分析；
f) Edu-MSCs-AuS-TA 在 FLS 中的胞内运输。
图4. AuS-TA 和 Edu-MSCs-AuS-TA 的内吞分析
5、其他结果
【本文只列举部分结果，更多结果见原文】
（1）验证Edu-MSCs-AuS-TA 的免疫调节能力
a) 利用 Edu-MSCs-AuS-TA对RA FLS和OA FLS进行免疫调节；
b) 在RA患者衍生FLS中，Edu-MSCs、AuS-TA 和 Edu-MSCs-AuS-TA 能够下调促炎性细胞因子（TNF-α、IL1和IL6）的表达，上调抗炎细胞因子（IL4、IL10和Arg-1）的表达；
c) 在OA 患者衍生 FLS中，EduMSCs、AuS-TA 和Edu-MSCs-AuS-TA 能够下调促炎细胞因子（TNF-α、IL1和 IL6）表达，上调抗炎细胞因子（IL4、IL10 和 Arg-1）表达。
（2）Edu-MSCs-AuS-TA 可以防止关节炎恶化并表现出软骨保护特性（体内试验）
a) 建立动物模型并设计实验方案：给6周大的DBA/1雄性小鼠注射胶原蛋白，诱发关节炎；b) 给小鼠爪子分别注射生理盐水、Edu-间充质干细胞、AuS-TA、Edu-间充质干细胞+AuS-TA（混合）和 Edu-间充质干细胞-AuS-TA（共轭物），并用苏木精-伊红染色和 safranin-O 染色进行观察；
c) DBA/1 小鼠在生理盐水、Edu-MSCs、AuS-TA、Edu-MSCs+AuS-TA（混合）和 Edu-MSCs-AuS-TA （共轭物）处理下的爪肿胀评分；
d) 显微镜观察软骨的OARSI 评分（OARSI 评分指根据软骨的结构、细胞性和软骨细胞克隆进行评分）
三、结论
关节炎是一种影响生活质量的慢性疾病，目前还没有针对 OA 和 RA 的理想治疗策略，因此需要开发能够有效促进组织重塑和修复的药物。在本文中，炎症介导的教育过程能够促进间充质干细胞向炎症关节迁移的能力，并调节分泌因子增强了抗炎效果（上调抗炎相关基因表达的同时下调促炎相关基因表达）。设计的 Edu-MSCs-AuS-TA能有效诱导抗炎微环境的形成（巨噬细胞再极化和抑制中性粒细胞招募）、促进软骨再生并减少骨侵蚀，在关节炎模型中，当其与 PTT 联合使用时不仅能阻止关节炎进展，还能逆转关节炎的晚期阶段。
翻译文稿不免出现笔误，还请各位读者指正和谅解！如有遗漏，欢迎留言补充。
排版丨壹 万
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