iMeta | 陈诚/郑道君组-联合解析植物自噬功能多样化的演化规律

多倍化驱动自噬参与植物特异性功能

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●  多倍化驱动自噬相关基因扩张，参与植物特异性功能;

●  多倍化影响植物自噬基因功能的获得与丢失；

●  自噬与叶绿体分裂、开花等的相互作用体现了植物自噬功能的多样化机制。

引  言

自噬是一种高度协调的生物学过程，其核心机制是通过自噬相关蛋白逐步形成自噬小泡，将底物包裹并转运至特定区域进行降解。尽管这一基本机制在不同真核生物中具有高度保守性，但随着演化自噬逐渐参与到更多的生物学过程中。在单细胞酵母中，自噬几乎完全与细胞物质的循环利用相关。自噬缺陷会阻碍多种生物学过程，包括细胞器重塑、神经元中的突触传递及胚胎发育。在植物中，自噬涉及幼苗发育、叶片衰老及胁迫响应等过程。然而，研究表明，除ATG4/6/8外，大多数植物自噬基因几乎无法弥补酵母同源基因敲除造成的功能缺陷。目前，对于自噬如何在植物中发展出特定功能仍然知之甚少。本研究利用多组学数据和演化策略，探究了驱动植物特异性自噬功能的演化机制。

通过构建植物自噬共功能网络，系统解析了自噬在植物中所参与的生物学过程。研究使用Gene Expression Omnibus（GEO）、ArrayExpress及CNGBdb等公共数据库中的近10,000个原始数据样本（图S1A，表S1），在转录、转录调控及蛋白互作水平上鉴定了自噬相关基因（AAGs）。在转录水平，利用Gene-Module Association Determination（G-MAD）工具，鉴定出10,964个与自噬（Gene Ontology，GO：0006914）相关的基因（图1A，表S2）。在转录调控水平，基于DNA亲和纯化测序（DAP-seq），鉴定出4,757个与自噬相关的基因（图1B，表S3）。在蛋白互作水平，从分馏质谱法（CF-MS）数据中，鉴定出12,675个自噬相关基因（图1C，表S4）。

根据G-MAD的结果，采用Module-Module Association Determination（M-MAD）工具，建立了自噬与其他生物功能的关联，并基于模块间关联评分（MMAS）构建了植物自噬共功能网络（表S5）。重叠分析显示，不同水平关联的自噬相关基因功能差异显著，但趋于执行相似的生物学功能。这些基因包括mRNA加工调控、负调控生长及正调控程序性细胞死亡等1,490个已知自噬基因和细胞外刺激调控的细胞生长、正调控植物醇生物合成及铁离子隔离等3,419个潜在自噬基因（图1D，表S5）。

进一步分析发现，转录、转录调控及蛋白水平中共享997个核心自噬相关基因（Core AAGs）（图1D）。这些基因与自噬数据集（GSE156677）显著相关，而与随机数据集无显著相关性（图1E，表S6）。因此，我们将这997个基因定义为核心自噬相关基因。

为揭示植物自噬功能的演化驱动力，我们利用上述997个基因，在77种植物中鉴定了92,967个AAG同源基因（表S7, S8）（p值 < 1×10⁻¹⁰，氨基酸同源性 > 60%）。例如，在水稻（Oryza sativa）中鉴定到1,117个，在番茄（Solanum lycopersicum）中1,479个，在油茶（Camellia oleifera）中1,927个，在葡萄（Vitis vinifera）中1,387个。基于MCScanX的基因重复事件分析，将这些AAG同源基因分为五类：单拷贝基因（4,659个；5.01%）、分散基因（30,468个；32.77%）、邻近重复基因（2,733个；2.94%）、串联重复基因（12,629个；13.58%）及多倍化相关基因（42,478个；45.69%）（图1G，表S8）。值得注意的是，在植物陆地化过程中，自噬相关基因在各基因组中的占比显著增加，多倍化相关基因显著过度表达（p = 1.55E-15），而其他基因组群组则显著低表达（图1H，表S9）。在陆生植物中，多倍化（p = 6.66E-16）是主要的驱动机制，自噬相关基因在代表性基因组中占比1.19%−7.47%（图1H，I，表S10）。这一结果表明，多倍化驱动了植物自噬相关基因的形成。

图1. 植物自噬的共功能网络

（A）利用基因模块关联确定法（Gene-Module Association Determination, G-MAD）鉴定与自噬相关的基因（AAGs）。（B）通过DNA亲和纯化测序（DAP-seq）鉴定自噬相关的转录因子。（C）利用分馏质谱法（Co-fractionation Mass Spectrometry, CF-MS）鉴定与自噬相关的基因。（D）Venn图显示在转录水平、蛋白水平和转录调控水平上与自噬相关的基因及其功能。（E）核心AAGs与自噬数据集（GSE156677）或随机数据集的关联网络。统计显著性通过比较网络复杂性（边的数量）和相关性程度（边的颜色）评估（p < 0.01）。（F）基于先前研究绘制的植物系统发育树。（G）各基因组中AAGs在全部注释基因中的比例。颜色饱和度越高，比例越大。（H）基因分类的热图显示其相对于全基因组平均值的显著性水平，其中富集基因标记为红色（p < 0.01），无显著差异的基因标记为黄色。（I）陆生植物中不同基因类别的比例变化：显著增加（黄色，p < 0.01）或无显著差异（绿色）。

在人类、酵母及植物中，自噬共功能网络分析表明，它们共享50项功能，例如脂质氧化、未折叠蛋白的细胞响应及依赖修饰的蛋白分解代谢等（图2A，表S11）。植物特异的自噬共功能包括叶绿体分裂、根毛伸长及细胞壁大分子分解等（图2B，表S11）。进一步分析显示，多倍化相关的自噬基因显著关联植物特异功能，如叶绿体分裂，而其他基因组群组则无此特性（图S1C，表S12）。此外，在单子叶植物（水稻）及双子叶植物（拟南芥）中，进一步比较多倍化AAGs的功能获得与丢失发现，水稻的434个及拟南芥的936个多倍化AAGs形成了62个一对一单拷贝直系同源组、69个一对多同源组及38个多对多同源组。在非生物胁迫响应中，拟南芥中81个AAGs和水稻中90个AAGs参与该过程，共形成68个直系同源组（图2C，表S13）。尽管基因扩展可能导致功能冗余，例如水稻中的Os01t022730001与拟南芥中的AT1G49300和AT3G18820形成同源组，功能分析表明它们在拟南芥中功能冗余。但有些功能可能在演化中丢失，例如拟南芥中的MPK3、MUM1和RPL23AA参与氧化胁迫响应，而水稻中缺失了这些基因（表S13）。

图2. 多倍化AAGs的功能分化

（A）基于模块-模块关联确定法（Module-Module Association Determination, M-MAD），分析拟南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryza sativa）、番茄（Solanum lycopersicum）、酵母（Saccharomyces cerevisiae）和人类（Homo sapiens）中与自噬相关功能的Venn图。（B）基于M-MAD分析拟南芥、水稻和番茄中与多倍化的AAGs功能，数据以模块-模块关联评分（MMAS）表示。（C）使用TBtools构建拟南芥和水稻中AAGs的系统发育关系图。红色表示拟南芥，深绿色表示水稻，蓝色表示一对一直系同源组，橙色表示一对多同源组，绿色表示多对多同源组。（D）水稻中的Os01t022730001基因与拟南芥中的AT1G49300和AT3G18820形成直系同源组。该基因在拟南芥中扩展，但其在氧化胁迫响应中的功能得以保留，并且两个基因在功能上具有冗余性。（E）基于M-MAD分析自噬的共功能网络，颜色深浅表示共功能网络的MMAS值。（F）基于G-MAD方法，分析叶绿体分裂基因（CDGs）和AAGs的共享基因Venn图。（G）AAGs与CDGs的共享基因分布。每个基因包含两个基因模块关联评分（GMAS）：X轴表示自噬的|GMAS|，Y轴表示叶绿体分裂的|GMAS|。定义|GMAS| > 0.2的基因为高可信基因（用红点表示）。（H）数据集（GSE184340）中显著差异表达的基因（p ≤ 0.05，倍数变化 ≥ 1.5），其中红色表示上调基因，蓝色表示下调基因。

本研究通过构建植物自噬共功能网络并重建核心AAGs的演化历史，揭示了多倍化如何推动自噬参与植物特异功能。多倍化事件不仅增加了自噬相关基因的数量，还影响了相关功能的获得与丢失。尤其是自噬与叶绿体分裂的相互作用，为植物自噬功能的多样化提供了新视角。本研究加深了对植物自噬的理解，并为该领域的进一步探索提供了新的思路。

方  法

数据来源与序列获取

目标物种的转录组数据从NCBI下载。此外，我们还获取了拟南芥DAP-seq和CF-MS数据集，以及拟南芥群体数据（GEO: GSE43858）、1001基因组计划（GEO: GSE80744）和OneKP项目的数据集（见表S1）。

GeneBridge分析

为了消除潜在的混杂变量，我们首先使用PEER工具对数据进行预处理。随后，数据被导入GeneBridge工具包进行后续分析。在GeneBridge工具集中，来自不同资源的本体术语、生物学通路的基因集合均称为“模块”。在本研究中，仅使用了本体术语。为了确定潜在的基因功能，GeneBridge工具包中的G-MAD工具利用了大规模样本群的表达数据。G-MAD使用相关性调整平均排名基因集测试（CAMERA）来确定相关基因与生物模块之间的联系。CAMERA是一种竞争性基因集测试方法，能够考虑基因间的相关性。对于经过多重检验校正后仍显著的基因-模块相互作用，依据富集方向分配结合得分为1或-1；否则得分为0。在数据集的元分析中，根据模块内的基因间相关系数（¯p）和样本规模，对结合得分进行加权，生成基因-模块关联评分。基于跨物种转录组数据集，GeneBridge工具包中的M-MAD工具用于识别模块间的联系。通过比较G-MAD结果中各模块对所有基因的得分，确定基因对所有模块的相关性。目标模块的基因富集得分由CAMERA方法生成的基因级数据计算得出。根据Bonferroni阈值，将跨模块p值简化为1、0或-1，并对所有数据集进行元分析，生成MMASs。利用完整表达数据集构建模块关联网络，并通过已发表的基因注释建立模块相似性网络。模块关联网络可发现文献中未记录的模块间新生物学联系。

77种植物基因组中AAGs的识别

首先，从77种不同植物物种中下载其基因组序列（见表S7）。然后，将拟南芥中在蛋白水平、转录水平和转录调控水平共享的997个AAGs，利用BlastP程序在蛋白序列中进行搜索，设置E值阈值为1×10⁻¹⁰，氨基酸同一性大于60%。随后，在NCBI数据库中对识别的序列进行BlastP分析，以获取注释信息。最后，根据注释信息筛选出所有物种的AAGs（见表S8）。

AAG复制类型的鉴定

基于以往研究，利用MCScanX的基因重复分类器程序，确定不同类型的重复基因，并计算每种特定重复事件在AAGs中的比例。

多物种直系同源基因的鉴定

拟南芥和水稻中的AAG直系同源基因通过OrthoFinder2推断，采用默认设置。首先推导出多序列比对（MSAs），然后基于这些MSAs推导基因树。

转录组分析

利用DESeq2软件包对每个样本的基因表达水平（BaseMean）进行归一化处理，并使用padj（校正后的p值）< 0.05的阈值，鉴定各比较组的差异表达基因（DEGs）。

相关网络的构建与可视化

使用来自GitHub的R包imsbInfer构建相关性网络。相关性通过Pearson秩相关系数计算。在网络图中，正相关用红色边表示，负相关用蓝色边表示。

统计分析

实验数据采用Origin Pro 2021软件（OriginLab公司）进行分析。组间差异通过最小显著差异（LSD）法进行检验，统计显著性的阈值设定为0.05和0.01。

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“iMeta” 是由威立、宏科学和本领域数千名华人科学家合作出版的开放获取期刊，主编由中科院微生物所刘双江研究员和荷兰格罗宁根大学傅静远教授担任。目的是发表所有领域高影响力的研究、方法和综述，重点关注微生物组、生物信息、大数据和多组学等前沿交叉学科。目标是发表前10%(IF > 20)的高影响力论文。期刊特色包括中英双语图文、双语视频、可重复分析、图片打磨、60万用户的社交媒体宣传等。2022年2月正式创刊！相继被Google Scholar、PubMed、SCIE、ESI、DOAJ、Scopus等数据库收录！2024年6月获得首个影响因子23.8，位列全球SCI期刊前千分之五(107/21848)，微生物学科2/161，仅低于Nature Reviews，学科研究类期刊全球第一，中国大陆11/514！

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