iMeta | 内蒙古农业大学-解析益生菌对本地肠道微生物群的影响

短期补充益生菌可影响本地肠道微生物群的

多样性、基因、生长速率和相互作用

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●  采用高剂量益生菌Probio-M8对人群进行干预，并对多个纵向时间点的粪便样本进行深度宏基因组测序，从宏观和微观多样性的角度解析益生菌对肠道微生物群的影响;

●  补充益生菌可显著提高肠道微生物组的多样性，并影响本地肠道细菌的单核苷酸变异、生长速率和共丰度网络；

●  肠道微生物会迅速适应益生菌引起的选择压力，生态变化可能先于进化变化。

引  言

人类肠道中蕴藏着高度多样化和动态的微生物群，其在维持整体健康和生理稳态中发挥着至关重要的作用。益生菌被定义为在摄入足够数量时能够对宿主健康产生有益作用的活性微生物。近年来，临床前和临床研究均已证明益生菌补充剂在管理各种健康状况方面的潜力。然而，益生菌的作用效果可能因人而异，突显了根据个体微生物组特征来调整益生菌干预措施的重要性。

外源性益生菌菌株进入肠道后，不仅能在物种层面上影响本地微生物群，还能在菌株水平上对其产生影响。由于肠道微生物群的功能贡献在很大程度上取决于菌株水平的活性，因此需在更精细的层面上分析微生物的生长动态，以全面了解益生菌如何调节肠道微生物群。目前，临床研究中最常用的益生菌剂量为每天 10⁶ - 10⁹ CFU，且使用较高剂量的情况越来越常见。然而，关于这些益生菌的持久性和定植能力仍然存在知识空白，尤其是在健康个体中，这些特性是否转化为增强的健康益处仍不明确。更为重要的是，目前仍不清楚高剂量益生菌干预如何在更精细的分类学和基因水平上影响宿主肠道微生物群及其在肠道生态系统中的相互作用。

为了填补这些空白，本研究选择了已被证实对肠道健康有积极影响的益生菌菌株Probio-M8，并在短期干预研究中，以每天2000亿CFU的高剂量给予健康个体。同时对多个时间点的粪便样本进行深度宏基因组测序，以从宏观和微观多样性的角度探究益生菌对肠道微生物群的影响（图1A，表S1）。另外，以Probio-M8为核心的生态调节网络表明，微生物群落经历了快速的生态调整，并且这些调整可能先于长期的遗传进化。

结  果

益生菌Probio-M8可提高肠道微生物群多样性

为了准确评估益生菌在肠道微生物群中的丰度和影响，生成全面的数据至关重要。为此，本研究采用了比一般研究高5到10倍的测序深度。经过严格的质量控制和去除宿主DNA后，共得到4.98 TB的高质量测序数据，平均每个样本的测序量为 41.53 ± 5.20 GB，确保了后续分析的稳健性和可靠性。基于这一广泛的宏基因组数据集，组装出4878 个高质量MAGs（完整性 > 80%，污染 < 5%），最终确定了507 个物种，其平均核苷酸同一性为95%，基因组比对率为30%。

随后用α多样性指数（香农和辛普森指数）评估了益生菌干预对肠道菌群宏观多样性的影响。最初，在益生菌干预前的7天和第0天两组之间的α多样性指数没有显著差异，表明干预前肠道微生物群的多样性是稳定的。在补充Probio-M8之后，α多样性指数显著升高（p < 0.05；图1B、C和表S2），表明益生菌干预有效地增加了肠道微生物群的多样性。然而，α多样性的增加是暂时的，因为之后保持稳定。因此，尽管短期高剂量的益生菌摄入可以增强菌群多样性，但可能不足以在复杂的肠道生态系统中引起持久的变化。

为了进一步探究益生菌干预对肠道微生物群组成的影响，基于Bray-Curtis距离进行了主坐标分析和相似性分析。结果表明，干预后肠道微生物群的总体组成没有显著变化（图S1A、B）。因此，尽管短期高剂量的Probio-M8干预有效增强了微生物群的多样性，但并未显著改变本地微生物群的群落组成。

为了识别在干预期间丰度发生变化的肠道微生物物种，进行了差异物种分析，包括Dialister hominis、Bifidobacterium animalis和Eubacterium_G ventriosum（图1D、E和表S3）。其中，Adlercreutzia equolifaciens、UMGS1474 sp900547105和Eubacterium_G ventriosum在干预后丰度增加，并在停止益生菌摄入后减少，而Dorea_A longicatena_B和Dialister hominis在干预后丰度也增加，但其丰度随后有所波动。值得注意的是，相较于基线期，在第7 天时Bifidobacterium animalis的丰度显著增加（图1E）。通过平均核苷酸一致性分析确认，丰度增加主要归因于补充的Probio-M8菌株。然而，这一增加是暂时性的，因为在停止益生菌干预后，Bifidobacterium animalis的丰度恢复至基线水平。这些结果表明，停止摄入Probio-M8无法维持其在肠道中的高丰度，强调了益生菌持续摄入对实现长期效果的必要性。

益生菌Probio-M8可影响肠道微生物群的微观多样性和生长速率

为了进一步了解可能由外部因素驱动的肠道微生物群内部的遗传变化，考虑进化压力的作用至关重要。这些压力可诱导微生物群落的微观多样性，进而影响肠道生态系统的整体结构和功能。通过对肠道微生物群中的单核苷酸变异（SNVs）进行分析发现，与基线期（-7 天和0 天）相比，Probio-M8干预7 天后，出现SNVs的物种数量增加，但无显著性差异（图1F）。进一步分析了reads覆盖率至少为0.4的物种，比较干预前后（0 天和7 天）的碱基变化。根据干预前后是否有超过50%的位点差异，SNV位点被分类为共享或非共享。在所有位点中，共识别出11 个共享位点和2,442 个非共享位点。其中，6 个位点为同义突变。基于COG数据库的功能注释显示，这些位点的功能包括肌动蛋白交叉反应抗原、α-L-富糖苷酶和精氨酸琥珀酸合成酶（图1G和表S4）。2,442 个非共享位点分布在120 个基因中，其中21 个基因与碳水化合物转运和代谢相关（图1H）。

通过iRep指标评估了原位细菌复制率，该指标根据宏基因组数据集估算基因组复制速率，从而为肠道微生物的生长和活细菌比例提供见解。iRep值越接近2，复制速率越高。结果显示，不同肠道微生物对Probio-M8的反应各异（图1I、J）。例如，Enterocloster sp000431375表现出最高的iRep值，但其生长速率在接受益生菌干预后降低。然而，需要注意的是，尽管iRep值较高，但它仍然是肠道微生物群中的非优势物种。这一观察结果突显了一个事实：在复杂的微生物群落中，细菌的快速复制不一定导致种群数量的增加，因为细菌丰度的绝对数量受多种因素的影响，如物种的原始丰度以及生态相互作用（如竞争、捕食和细胞死亡）。此外，研究了不同时间点细菌的复制速率，发现不同菌株在益生菌摄入后的复制速率存在差异（图1J）。值得注意的是，生长速率研究仅限于基因组复制动态的评估，未能揭示细胞死亡率。值得注意的是，在专门分析Bifidobacterium animalis时发现，在Probio-M8摄入后其复制速率有所增加，iRep值在第14 天几乎达到了2（图1K）。且对iRep指标的变化进行分析发现不同肠道微生物生长速率不同（图1L）。

总体而言，这些结果表明，短期高剂量摄入益生菌Probio-M8不仅调节了特定肠道细菌分类群的相对丰度，还影响了本地肠道微生物群的微观多样性及生长动态。

图1. 试验设计和益生菌干预后肠道微生物群关键微生物特性的变化

(A) 干预试验时间轴的示意图。(B) 香农多样性指数箱形图。(C) 辛普森多样性指数箱形图。（D） 基线（0 d）和益生菌干预后各个时间点（7 d、14 d、21 d和28 d）之间差异物种分布。(E) 试验期间不同时间点差异SGB的平均相对丰度。使用Wilcoxon等级和检验评估时间点之间的统计学差异，p < 0.05被认为是显著的。(F) 试验期间出现SNV的物种数量。(G) 共享位点的基因位置和相应的突变类型。(H) 基因数量和非共享位点的相应功能类型。(I) 干预前（0天）细菌物种的iRep值。(J) 不同时间点，细菌物种的iRep值变化。(K) 不同时间点上，益生菌Probio-M8摄入后，Bifidobacterium animalis的平均iRep值。(L) 在干预前（0天）至少有三分之一的样本中被注释到irep指数的细菌，在两个时间点之间的iRep值差异。颜色尺度表示差异的大小，偏红表示差异增加，偏蓝表示差异减少。

益生菌Probio-M8可改变肠道微生物的生态

为了评估Probio-M8干预是否会导致肠道微生物群落发生基因变化，基于优势物种在微生物群中的普遍性和重要影响，重点分析了前八大优势物种的SNVs。考虑到SNV与测序深度呈正相关，将SNV数量与测序深度进行了归一化处理（nSNVs），计算公式为：nSNVs = SNV 数量/每个样本的测序深度。尽管与基线相比，Faecalibaterium prausnitzii_G、Phocaeicola dorei、Escherichia coli、Alistipes putredinis 和 Faecalibaterium prausnitzii等优势物种的相对丰度在干预后发生了明显变化（图 2A、B、S1C，p < 0.05），但在任何时间点都没有观察到这些物种的nSNV存在显著差异。这些发现表明，虽然Probio-M8的干预导致肠道微生物群落发生了显著的生态变化，但在研究期间，这些变化并没有伴随着优势物种的显著遗传适应性变化。此外，我们的研究结果与之前的一项荟萃分析结果一致，后者报告了摄入益生菌后有限的生态变化，同时指出了单个肠道微生物内广泛的基因改变。这些比较突显了微生物对益生菌反应的复杂性，表明虽然生态变化可能发生得很迅速，但重要的遗传适应可能需要更长时间的接触或特定的环境条件。要更全面地探索这些动态变化，尤其是在不同种群和更长的时间上的动态变化，还需要进一步的研究。

益生菌Probio-M8可增强肠道微生物群落的共丰度网络

为了评估Probio-M8干预对肠道微生物群落内相互作用动态的影响，我们采用Spearman相关性分析来评估细菌间关系随时间的变化，结果表明，服用Probio-M8会影响肠道微生物网络内相互作用的强度和复杂性（图 S1D）。

对涉及Probio-M8的相关性进行更详细的研究发现，在第7 天，Probio-M8 与其他本地肠道微生物的关联数量最多，这表明干预后其相互作用网络增强（图 2C）。通过量化网络中的节点和边数，发现这两个指标在第7天达到峰值，但在随后的随访中出现下降，表明这种增强的连接性是暂时的（图2D-G，及表S5）。总之，益生菌Probio-M8干预可暂时增强肠道微生物群落内的互联性，强调了肠道微生物群体对益生菌干预的动态生态响应。为益生菌诱导的微生物生态转变具有的暂时性提供了宝贵的见解。

图2. 益生菌干预对肠道微生物群的相对丰度、遗传多样性和共丰度网络的影响

(A) Phncaeicola dorei 的相对丰度和标准化单核苷酸变异数（nSNVs；下方图）的变化。(B) Faecalibacterium prausnitzii_G 的相对丰度和标准化单核苷酸变异数（nSNVs；下方图）的变化。不同时间点的数据如下：益生菌干预前（-7天和0天）、干预后（7天），以及随访期（14天、21天和28天）。采用Wilcoxon秩和检验来评估不同时间点之间差异的统计学显著性，p < 0.05为显著差异。(C-F) 共丰度网络图展示了在益生菌Probio-M8 摄入后，不同时间点（7天、14天、21天和28天）Probio-M8与其他肠道本地细菌之间的相关性。橙色线条表示正相关，灰色线条表示负相关。线条的粗细表示相关性的强度，粗线表示相关性更强。圆圈的大小表示节点的数量，圆圈越大，表示节点越多。(G) 益生菌摄入后，不同时间点（7天、14天、21天和28天）Probio-M8与其他肠道本地细菌之间相关网络的节点数和边数。

结  论

本研究采用深度宏基因组测序技术评估了肠道微生物群对高剂量益生菌干预的原位变化，为解析益生菌与本地肠道微生物群落之间错综复杂的相互作用提供了重要见解。短期服用高剂量Probio-M8提高了肠道微生物的多样性，并影响了关键的微生物特性，包括核苷酸变异、生长速率和细菌间的相互作用，突显了益生菌对肠道生态系统生态平衡的重大影响。值得注意的是，肠道微生物在短期内能迅速适应益生菌诱导的压力，生态变化往往先于遗传进化，强调了微生物群落响应的复杂性和多面性。虽然本研究的样本量有限，但这些发现为了解益生菌诱导的肠道微生物群变化的暂时性提供了宝贵的视角。未来需要进行大规模、多人群研究，以深入理解益生菌与微生物群的相互作用，为益生菌的设计和应用提供新的数据支持。

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“iMeta” 是由威立、宏科学和本领域数千名华人科学家合作出版的开放获取期刊，主编由中科院微生物所刘双江研究员和荷兰格罗宁根大学傅静远教授担任。目的是发表所有领域高影响力的研究、方法和综述，重点关注微生物组、生物信息、大数据和多组学等前沿交叉学科。目标是发表前10%(IF > 20)的高影响力论文。期刊特色包括中英双语图文、双语视频、可重复分析、图片打磨、60万用户的社交媒体宣传等。2022年2月正式创刊！相继被Google Scholar、PubMed、SCIE、ESI、DOAJ、Scopus等数据库收录！2024年6月获得首个影响因子23.8，位列全球SCI期刊前千分之五(107/21848)，微生物学科2/161，仅低于Nature Reviews，学科研究类期刊全球第一，中国大陆11/514！

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