iMetaOmics | 兰大南志标/段廷玉组-丛枝菌根网络影响邻近植物对病原菌的响应

丛枝菌根网络增强了邻近植物对病原菌的防御反应

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●  丛枝菌根网络（Common mycorrhizal networks，CMNs）为植物间通讯提供了渠道，使不同物种的植物能够在没有直接接触的情况下为病原菌侵染做好准备；

●  在供体植物感染病原体后，CMNs会改变邻近植物的叶际微生物丰度和群落结构，增强邻近植物中的微生物相互作用和网络复杂性；

●  这种激活可能会触发受体植物对潜在病原菌的防御反应，从而增强系统抵抗病原菌侵染的能力。

引  言

丛枝菌根（arbuscularmycorrhizal，AM）真菌广泛分布于陆地生态系统中，是重要的土壤功能微生物，其可与各种草本植物形成共生关系。AM真菌可改善宿主植物对矿物质营养的吸收，增强宿主对病原菌和害虫的抗性。由于AM真菌对宿主植物缺乏特异性，因此外部菌丝体可以将各种植物物种的根以及同一物种的个体相互连接，在地下形成庞大的丛枝菌根网络（Commonmycorrhizalnetworks，CMNs）。CMNs可以调节植物个体之间的竞争并重新分配其营养资源。例如，CMNs扩大了万寿菊（Tagetes tenuifolia）在土壤中释放的化感物质的生物活性区，抑制了邻近植物的生长。此外，CMNs可作为碳和矿物质营养的传输管道，提高植物对营养物质的运输效率。除了在植物之间转移矿物质营养物质外，CMN还可以传递胁迫防御信号。先前的研究结果表明，当植物遇到病原菌感染和昆虫取食时，CMNs会在植物之间传递防御信号，这种信号传递诱导了邻近植物的防御反应，在昆虫和病原菌侵染之前有效地起到了早期“预警”的作用。例如CMNs在受到植物病原菌或害虫的攻击后迅速传递信号化合物，诱导邻近植物的防御反应。无蚜虫取食的蚕豆（Vicia faba）通过CMNs与豌豆蚜（Acyrthosiphon pisum）取食蚕豆相连后，改变了健康蚕豆的挥发性化合物含量和组成，进而趋避豌豆蚜并吸引豌豆蚜的天敌，增强了对豌豆蚜侵染的抵抗力。CMNs将病原物入侵的信号从受感染的枳（Poncirus trifoliata）幼苗转移到邻近的健康幼苗，诱导水杨酸（SA）等防御物质含量升高，激活防御反应，保护邻近植株免受溃疡病（Xanthomonas axonopodis）的危害。番茄（Lycopersicon esculentum）通过CMNs连接增强了抗病性，并诱导了与感染叶早疫病（Alternaria solani）番茄相连的健康番茄中的防御酶活性，包括脂氧合酶、苯丙氨酸解氨酶、过氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）。这些发现表明，植物之间可以通过CMNs传递防御信号。CMNs的这种地下植物间信号传递方式对植物病虫害管理具有巨大的潜力。

目前的研究主要集中在CMNs介导的防御信号在同一物种的植物之间的传递，如蚕豆、马铃薯（Solanum tuberosum L.）、番茄（Solanum lycopersicum L.）、烟草（Nicotiana attenuata）和枳（Poncirus trifoliata [L.] Raf）等。然而，在自然生态系统中，不同的植物物种之间经常共存，并通过CMNs连接。例如，亚麻（Linum usitatissimum L.）和高粱（Sorghum bicolor L.）、羊草（Leymus chinensis）和隐子草（Cleistogene squarrosa）、多年生黑麦草（Lolium perenne L.）和白三叶（Trifolium repens L.）等可以通过AM真菌形成CMNs相互连接。CMNs有助于转移营养物质并提高生产力。此外，CMNs还可能有助于促进植物间通讯以及植物对不同植物物种之间生物和非生物胁迫的防御。这些发现强调了CMNs的重要性，以及迫切需要对其在传递抗逆信号方面的功能和作用进行进一步研究，特别是在探索可持续农业病虫害管理策略方面。

叶际是地球上最大的生物表面，拥有各种各样的功能微生物群，在植物生长、抗逆性和生产力中发挥着至关重要作用。这些微生物组可以防御植物病原菌。例如，之前的一项研究表明，感染柑橘砂皮病菌（Diaporthe citri）的柑橘叶片和未感染的柑橘叶片之间叶际生物组之间存在显著差异，并强调了与微生物组组成变化相关的几种细菌，这些细菌在病原菌D.citri入侵下对植物生长和抗逆性产生了积极影响。另一项研究表明，芽孢杆菌（Bacillus）和木霉菌（Trichoderma）改变了箭筈豌豆（Vicia sativa）叶际细菌群落的组成和丰度，这些变化与植物防御酶多酚氧化酶（PPO），以及茉莉酸（JA）和一氧化氮（NO）等信号分子密切相关。众所周知，AM真菌可调节植物根际和菌丝际的微生物，且植物根系和根际可以与植物的地上部分共享微生物群，地下根系和根际微生物是植物叶际微生物群的关键贡献者。值得注意的是，尽管之前有研究表明水分胁迫和菌根侵染改变了植物叶际微生物组的组成，AM真菌显著增加了玉米（Zea mays L.）内生微生物群落的多样性。但是，AM真菌对植物叶际微生物影响的研究仍然较少，且尚无关于CMNs背景下对植物叶际微生物影响的相关研究。

多年生黑麦草（L. perenne）和白三叶（T. repens）均是重要的优质饲草和草坪草，二者混播是重要的栽培草地模式。研究表明，白三叶和黑麦草之间可以建立丛枝菌根网络，并且CMNs会在植物生长、砷吸收、磷营养竞争等相互作用中发挥重要作用。然而，现阶段尚未见探索白三叶和黑麦草之间通过CMNs传递抗病信号的相关研究。鉴于此，本研究旨在探索病原菌侵染供体白三叶后，对CMNs连接的受体黑麦草的防御化合物和叶际微生物组的影响，研究了植物防御酶、微生物多样性、群落结构和网络复杂性等，同时揭示防御化合物与叶际微生物组之间的相关性。此外，如果CMNs可以充当感病白三叶和健康黑麦草之间的信号化合物传递的导管，我们假设：（1）通过CMNs与感病白三叶相连的黑麦草表现出与感病白三叶相似的防御反应，从而诱导防御化合物和叶际微生物的变化；（2）CMNs改变叶际的微生物多样性和群落结构，且与防御化合物的变化有关，并可能在植物抵抗病原菌中发挥作用。

结  果

菌根定殖和植物生长

AM-L-（受体黑麦草接种了AM真菌，未通过CMNs与供体白三叶连接）和NM-L+（受体黑麦草未接种AM真菌，但通过CMNs与供体白三叶连接）处理的黑麦草根系中均检测到了菌根定殖（图S1），表明AM真菌菌丝可通过37µm尼龙网在地下形成菌丝网络，连接供体和受体植物，且AML-处理和NML+处理的菌根侵染率均为70%~95%，两者之间没有显著差异（图S1）。在供体白三叶的根系中检测到了菌根结构，病原菌处理并没有显著影响白三叶的菌根侵染率（图S1）。

植物防御酶活性

CMNs连接后显著改变了受体黑麦草超氧化物歧化酶（SOD）（p < 0.001）、PPO（p = 0.002））和过氧化氢酶（CAT）（p = 0.014）的活性（图1A-D）。与健康白三叶相比，感病的供体白三叶中CAT和POD活性显著提高（p = 0.004，p = 0.028），而PPO活性则显著降低（p = 0.023） （图1E）。与AM-L-黑麦草相比，NM-L+黑麦草中的CAT和PPO活性显著增高（图1B、C）。值得注意的是，通过CMNs连接感病白三叶的黑麦草CAT活性水平显著高于连接健康白三叶的黑麦草，这表明防御信号可能通过CMNs在白三叶和黑麦草之间传递（图1A）。NM-L+黑麦草中的SOD水平低于AM-L-黑麦草（图1C）。

图1.实验装置和供体白三叶（Trifolium repens L.）和受体多年生黑麦草（Lolium perenne L.）的防御酶活性

（A）通过CMNs连接（NM-L+）或无连接（AM-L-）供体白三叶的黑麦草的过氧化氢酶、（B）多酚氧化酶、（C）超氧化物歧化酶和（D）过氧化物酶活性。（E）白三叶的过氧化氢酶、过氧化物酶、多酚氧化酶和超氧化物歧化酶活性；（F）实验装置。所有植物均接种AM真菌，但左侧植物无法与供体植物形成菌丝连接（0.45 μm尼龙网，左）。右侧植物被允许与供体形成CMNs连接（37 μm尼龙网，右）。P+：病原菌Stemphylium sarciniforme侵染供体白三叶处理。P-：无病原菌侵染供体白三叶处理。柱状图上方的不同小写字母表示通过LSD检验在p < 0.05各处理之间存在显著差异。水平线上方的不同大写字母表示AM-L-和NM-L+黑麦草在p < 0.05水平存在显著差异。使用独立样本t检验分析供体白三叶数据。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，n.s.：无显著差异。

植物激素和光合作用

黑麦草中SA、JA和NO的含量受CMNs连接的影响（p < 0.001）（图2A-C）。NM-L+黑麦草中SA、JA和NO的含量分别比AM-L-黑麦草高7.79%、21.58%和22.24%（图2A-C）。此外，通过CMNs连接与Donor-P+（P+：供体白三叶感染病原菌）白三叶连接的黑麦草，其丙二醛（MDA）含量高于与Donor-P-（P-：供体白三叶未感染病原菌）白三叶连接的黑麦草（图2D）。病原菌侵染后，供体白三叶MDA含量显著增高，而与健康白三叶相比，SA、JA和NO含量没有显著差异（图2E）。不同处理的供体白三叶和受体黑麦草的植物光合指标均没有显著差异（图S2）。

图2. 供体白三叶（Trifolium repens L.）和受体多年生黑麦草（Lolium perenne L.）的植物激素和丙二醛含量

（A）通过CMNs连接（NM-L+）或无CMNs连接（AM-L-）供体白三叶的黑麦草的水杨酸、（B）茉莉酸、（C）一氧化氮和（D）丙二醛含量。（E）供体白三叶的水杨酸、茉莉酸、一氧化氮和丙二醛含量。P+：病原菌Stemphylium sarciniforme侵染供体白三叶处理。P-：无病原菌侵染供体白三叶处理。柱状图上方的不同小写字母表示通过LSD检验在p < 0.05各处理之间存在显著差异。水平线上方的不同大写字母表示AM-L-和NM-L+黑麦草在p < 0.05水平存在显著差异。使用独立样本t检验分析供体白三叶数据。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，n.s.：无显著差异。

白三叶和黑麦草叶际微生物多样性

与NM−L+P−和AM−L−黑麦草相比，当供体白三叶感染病原菌时，NM−L+黑麦草表现出最高的真菌ASV丰富度，但差异并不显著（图3A）。值得注意的是，NM−L+P+黑麦草的真菌属丰富度明显高于NM−L+P−和AM−L−黑麦草（图S4）。NML+P+黑麦草的真菌Chao1指数明显低于NML+P−黑麦草（图3B）。NM-L+黑麦草的真菌ACE指数比AM-L-黑麦草高24.60%（图3C）。值得注意的是，受体黑麦草之间的细菌alpha-多样性没有显著差异（图S3）。AM-L-P+的细菌属丰富度高于NM-L+P-和AM-L-P-黑麦草（图S5）。结果表明，供体白三叶感病后改变了受体黑麦草的叶际真菌多样性。然而，与Donor-P-相比，Donor-P+白三叶的细菌alpha-多样性指数（包括Chao1、Shannon、Simpson和Pielou）较低（图S6）。Donor-P+白三叶和Donor-P-白三叶的真菌多样性水平相似（图S7）。

无论CMNs是否连接，白三叶和黑麦草的叶际真菌群落结构均存在显著差异（图3D，表S1）。NM-L+P-和NM-L+P+黑麦草叶片之间的真菌群落结构存在显著差异（p = 0.017）（图3E，表S1）。白三叶和黑麦草叶片中的细菌群落结构存在显著差异（p = 0.001）（图3F，图S8，表S2）。值得注意的是，无论供体白三叶是否感病，AM-L-和 NM-L+黑麦草之间的细菌群落结构均存在显著差异（p = 0.003）（图3G，表S2）。此外，感病白三叶叶片和健康白三叶叶片之间的细菌和真菌群落结构均存在显著差异（真菌：p = 0.006；细菌：p = 0.028）（图S9）。

图3. 叶际真菌alpha多样性和叶际微生物beta多样性

通过CMNs连接（NM-L+）或无CMNs连接（AM-L-）供体白三叶的黑麦草的叶际真菌（A） ASV丰富度、（B）Chao1指数和（C）ACE指数。（D-G）CMNs连接（NM-L+）或无CMNs连接（AM-L-）供体白三叶的的多年生黑麦草和供体白三叶的真菌（D、E） 和细菌（F、G）群落的NMDS分析。P+：病原菌Stemphylium sarciniforme侵染供体白三叶处理。P-：无病原菌侵染供体白三叶处理。柱状图上方的不同小写字母表示通过LSD检验在p < 0.05各处理之间存在显著差异。水平线上方的不同大写字母表示AM-L-和NM-L+黑麦草在p < 0.05水平存在显著差异。*p < 0.05，n.s.：无显著差异。

叶际微生物组成

黑麦草的叶际真菌门水平主要由子囊菌门（Ascomycota）和担子菌门（Basidiomycota）组成。Ascomycota在NML+P+黑麦草中所占比例最高，为58.22%，而在NML+P-黑麦草中占比最低，为48.22%（图S10）。Olpidiomycota在NML+P+黑麦草中表现出最高的丰度（2.90%），在其他三个黑麦草组（NML+P-、AML-P-、AML-P+）中相对丰度较低（图S10）。黑麦草叶片中存在的内生真菌在属水平上主要被归类为unclassified Basidiomycota，在四个黑麦草组（NML+P-、NML+P+、AML-P-、AML-P+）之间观察到的相对丰度无明显变化（图S10）。Olpidium在NM-L+P+黑麦草中的丰度最高（2.05%），在其他三个黑麦草组（NML+P-、AML-P-、AML-P+）中的丰度相对较低。值得注意的是，与Donor-P-（0.08%）白三叶相比，Donor-P+白三叶中Olpidium的丰度更高（1.10%）（图S10）。黑麦草中的叶际细菌主要由Proteobacteria组成。Proteobacteria在AML-P-黑麦草中的丰度最高（52.08%），在NML+P+黑麦草中丰度最低（29.09%）（图S10）。Desulfobacterota在NM-L+P+黑麦草中的丰度最高（1.33%），在其他三个黑麦草组（NML+P-、AML-P-、AML-P+）中的丰度相对较低（图 S10）。此外，与NML+P-（0.43%）和AML-P（-0.68%）黑麦草相比，NML+P+（1.06%）和AML-P+（1.91%）黑麦草在属水平上的Bacteroides丰度更高。与Donor-P-（1.13%）白三叶相比，Donor-P+白三叶中的Bacteroides丰度较低（0.35%）（图 S10）。

叶际共享微生物分析

NML+P+黑麦草中真菌ASV的比例略高，而与未感染病原菌的供体白三叶相比，感染病原菌的受体白三叶中真菌ASVs的比例较低（图4A、B）。病原菌侵染显著降低了供体白三叶中共享细菌性ASV的比例（图4C、D）。NML+P-和NML+P+之间共享细菌ASVs的比例保持一致。此外，Donor-P+与NML+P+（116）和Donor-P+和AML-P+（95）之间共享的真菌ASV差异不大。然而，与Donor-P+和AML-P+（60）相比，Donor-P+与NML+P+（135）的共享真菌ASV明显增加（图4E、F）。Donor-P-与NML+P-的共享细菌ASVs明显高于Donor-P-和AML-P-，从64增加到101。然而，当病原体感染白三叶时，Donor-P+与NML+P+（62）的共享细菌ASVs降低（图4G，H）。这些结果表明，白三叶和黑麦草的叶际微生物组可能通过CMN进行交流。

图4. 供体白三叶和有无CMNs连接处理黑麦草中真菌和细菌共享ASV

（A、B）真菌和（C、D）细菌共享ASV三元图。（E、F）真菌和（G、H）细菌ASV的维恩图。图中的每个圆点代表一个ASV，颜色表示主要发现它的区室。红色圆点表示在供体白三叶中发现的ASV比例 > 50%；绿色圆点表示在CMNs连接黑麦草中发现的ASV比例 > 50%；蓝色圆点表示在无CMNs连接黑麦草中发现的ASV比例 > 50%；橙色符号表示在所有区室中比例无明显差别的ASV。每个圆点的位置反映了所示区室对总相对丰度的贡献。

受体黑麦草叶际微生物的LEfSe分析

在NML+P+vs.AML-P+组中，总共鉴定出28个真菌特征属，其中只有2个真菌属在AML-P+中表现出更高的丰度（LDA得分更高），而另外26个真菌属则在NML+P+黑麦草中表现出较高的丰度（图5A）。这些包括Vishniacozyma和Glomeromycetes，这些微生物可能在抵抗病原菌方面发挥重要作用。在AM−L−P−和NML+P−之间总共鉴定出17个真菌特征属（图5B）。此外，还鉴定出53个真菌特征属，与 NM−L+P− 相比，NM−L+P+黑麦草中有39个真菌属表现出更高的丰度，包括Vishniacozyma和Glomus（图 S11）。进一步的相关性分析发现，CAT活性和MDA含量与Vishniacozyma和Glomeromycetes的相对丰度呈显著正相关关系（图5C）。此外，AM-L-P-和NML+P-之间共鉴定出26个细菌特征属，其中6个属微生物在NM-L+P+黑麦草中比AM-L-P-黑麦草中表现出更高的丰度（图S12）。这些结果表明，供体白三叶感染病原体后，CMNs可能会促使受体黑麦草产生更强烈的微生物响应。

图5. 多年生黑麦草（Lolium perenne L.）叶际真菌的LEfSe分析以及黑麦草叶际真菌过氧化氢酶活性、丙二醛含量与Vishniacozyma和Glomeromycetes微生物之间的回归方程

（A、B）通过CMNs连接（NM-L+）或无CMNs连接（AM-L-）的黑麦草的叶际真菌LEfSe分析。P+：病原菌Stemphylium sarciniforme侵染供体白三叶处理。P-：无病原菌侵染供体白三叶处理。特征微生物的线性判别分析LDA得分筛选获得不同处理中微生物的差异。红色柱表示NM-L+中丰度更丰富；蓝色柱表示AM-L-中丰度更丰富。（C）黑麦草叶际真菌过氧化氢酶活性、丙二醛含量与Vishniacozyma和Glomeromycetes微生物相对丰度之间的回归方程。图中显示了判定系数（R2） 和统计显著性。

叶际微生物共现网络及网络拓扑性质

通过构建叶际微生物网络，以探索不同处理白三叶和黑麦草的叶际微生物相互作用。结果发现，相较于健康白三叶，供体白三叶感病后的叶际微生物共生模式存在显著差异（图S13）。供体白三叶感病后，病原菌驱动感病白三叶叶际微生物网络变得更加复杂，表现为叶际微生物的真菌和细菌网络的总节点、边和平均度均高于供体健康白三叶（图S13）。

CMNs连接NML+P+处理黑麦草和其他处理（AM-L-P+、NM-L+P- 和 AM-L-P-）黑麦草之间的真菌微生物共现模式表现出显著差异，在真菌网络中，与其他处理黑麦草相比，NM-L+P+黑麦草叶际微生物的节点和边数目均为最高，分别为248和1363（图6A、B），值得注意的是，NM-L+P+中微生物网络的平均度最高，表明在CMNs连接感病白三叶的黑麦草叶际真菌群落的复杂性增加（图6B）。在细菌网络中，NM-L+P+黑麦草的边数目最高，为435，高于其他三种处理（图6C、D），这表明菌根连接黑麦草中的细菌网络更复杂（图6D）。

图6. 不同处理多年生黑麦草（Lolium perenne L.）的真菌和细菌共现网络

（A）AM-L-和NM-L+处理黑麦草真菌网络的可视化。（B）真菌网络的拓扑特性。（C） AM-L-和NM-L+处理黑麦草细菌网络的可视化。（D）细菌网络的拓扑特性。不同的门以不同的颜色显示。P+：病原菌Stemphylium sarciniforme侵染供体白三叶处理。P-：无病原菌侵染供体白三叶处理。

相关性分析

相关分析显示，CAT与MDA（p < 0.001）、JA与NO（p < 0.01）、SA与PPO（p < 0.05）呈显著正相关。SOD与PPO、MDA、JA、SA和NO呈显著负相关（p < 0.05）（图7A）。Mantel检验分析表明，PPO与真菌多样性显著相关（p < 0.05，mantel’r = 0.21）。PPO活性与真菌α多样性显著相关，包括ASVs丰富度、ACE、Chao1、Shannon、Simpson、Pielou指数。此外，CAT活性、MDA含量、真菌ASVs丰度和ACE指数之间存在显著的正相关关系（图7B-F）。CAT活性与细菌Shannon指数呈显著正相关（图S14）。

图7. 生理指标的相关性分析以及真菌ASV与生理指标的Mantel分析

（A）真菌ASV多样性与生理指标的Mantel分析。（B-F）真菌α多样性与（B、C、D）多酚氧化酶活性、（E）过氧化氢酶活性和（F）丙二醛含量之间的回归方程。显示了判定系数（R2）和统计显著性。CAT：过氧化氢酶，PPO：多酚氧化酶，MDA：丙二醛。*p < 0.05，**p < 0.01。***p < 0.001。

讨  论

在自然条件下，AM真菌可以在不同植物物种间建立CMNs。然而，目前的研究主要研究病原菌感染对同一宿主植物叶际微生物组的影响，而很少有研究在植物群落水平上研究AM真菌对植物对病原体侵染响应的影响，其中尚未见关于叶际微生物的研究。本研究提供了新的实验证据，表明病原菌侵染可以诱导不同植物物种之间邻近植物的防御反应。我们的研究结果表明，通过CMNs与白三叶相连的黑麦草具有更高的叶际真菌多样性指数，包括ACE、属和物种丰富度。通过CMNs与感病白三叶相连的黑麦草的叶际真菌群落结构发生改变。此外，通过CMNs相连的黑麦草和没有CMNs相连的黑麦草之间的细菌群落结构存在差异。这些观察结果表明，通过CMNs与白三叶相连的黑麦草具有最复杂的真菌微生物网络结构，这可能增强其对病原体的抵抗力。此外，CMNs改变了受体植物的叶际微生物组，并可能与诱导防御机制的能力相关，例如供体白三叶和受体黑麦草中CAT 活性的增加。这些发现表明，CMNs在塑造植物群落水平的防御反应方面发挥着至关重要的作用。

在NM-L+黑麦草中观察到菌根定殖，表明AM真菌菌丝在供体白三叶和受体黑麦草之间可以形成CMNs。此外，我们的试验设计最大限度地减少了土壤扩散以及根与根接触的潜在影响，主要关注植物之间菌丝连接的影响。5 cm PVC管形成缓冲区，并分别用0.45 µm和37 µm 尼龙网防止白三叶和黑麦草根部直接接触（图1F）。然而，在不同的自然条件下，根际AM真菌菌丝体以外的替代途径可以作为信号通道。例如，植物之间的信号传递可能通过水相液流或膜层发生，真菌菌丝体的存在可能会增强这些途径的形成我们研究使用的尼龙网是透水的，因此，我们防止菌丝连接的方法（0.45 µm尼龙网）不太可能抑制液体流或膜层的形成。因此，根系分泌物可能介导不同物种植物之间的植物间交流。如果根系分泌物介导植物间的交流，则可以在非CMNs相关黑麦草（AM-L-）中检测到诱导的防御反应。然而，我们观察到NM-L+中的CAT、PPO活性及JA、SA和NO的含量高于AM-L-处理黑麦草，表明当黑麦草没有通过CMNs与白三叶连接时，不会发生诱导防御反应。根据我们的试验设计和结果，我们将信号传递归因于AM真菌菌根网络，或可能归因于与CMNs相关的一些物理现象。

病原菌感染会降低植物的光合作用，影响植物的生长。然而，AM真菌倾向于通过CMNs为那些最能提供光合碳的植物提供矿物质营养，从而从植物群落中获得更多的碳回报。在本研究中，虽然白三叶被病原菌感染，但感病白三叶的光合作用与健康白三叶相似。值得注意的是，由于物种差异，白三叶的净光合速率明显高于黑麦草。此外，通过CMNs与感病白三叶相连的黑麦草的净光合速率最低，但差异并不显著。这可能是由于AM真菌通过CMNs向白三叶转移了更多的矿质营养物质造成的。

CMNs连接改变了受体黑麦草的防御酶活性和激素含量

本研究表明，CMNs在决定与病原菌侵染的供体相连的受体植物的响应中起着至关重要的作用。在通过CMNs连接的感病供体白三叶和受体黑麦草中的CAT活性均升高（图1）。这一结果表明，CMNs可能在植物群落水平上诱导植物防御酶响应，并可能增强生态系统中植物的抗性。此外，CMNs连接的黑麦草PPO、CAT和MDA水平显著升高。先前的研究表明，CMNs可以传递胁迫信号，保护邻近健康植物减少昆虫的侵害和抵御病原菌的侵染。本研究提供了新的证据，表明病原菌诱导的信号分子可以通过CMNs从感染植物转移到不同物种的未感染植物。这些发现支持了我们的假设，即通过CMNs与感病白三叶相连的黑麦草表现出与感病白三叶相似的防御反应，从而引起防御化合物的响应。

各种植物激素，包括生长素、水杨酸和茉莉酸，可以介导植物对病原菌侵染的防御。此外，NO也是植物防御反应中信号通路的重要调控成分。本研究表明，通过CMNs与白三叶连接的黑麦草中SA、JA和NO含量显著升高。这一现象可归因于白三叶和黑麦草通过CMNs共享防御反应信号物质，从而改善了整体系统的健康状况，且这一变化不一定取决于病原体是否感染供体植物。重要的是，不同物种的供体植物和受体植物之间可能发生了一些交流，因为通过CMNs连接的供体植物和受体植物中的防御酶活性都有所增加。在番茄与AM 真菌Glomus mosseae之间建立CMNs后，将病原菌接种到供体植物上，可增强邻近健康接收植物的抗病能力和假定防御酶POD、PPO、几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶、苯丙氨酸氨裂解酶和脂氧合酶的活性。这些发现表明植物防御酶可能是CMNs介导的重要植物响应化合物。

重要的是，通过CMNs在植物之间转移的信号化合物尚未被识别。信号化合物可能是已知在AM真菌菌丝中运输的分子，包括脂质，如三酰甘油、磷酸转运蛋白和氨基酸等。然而，迄今为止没有直接证据支持这一假设。此外，信号分子可能特定于AM真菌、宿主或病原菌的类型。尽管现阶段对通过CMNs转移的信号化合物在未感染植物中引发防御反应知之甚少，但确定CMNs运输的化合物并阐明调节由病原菌诱导的通过CMNs的信号传输机制是未来研究的重要目标。

CMNs改变了叶际微生物的多样性和群落结构，增强了受体黑麦草叶际微生物的网络复杂性

植物相关微生物群落在促进植物间交流方面很重要。病原菌侵染可以改变植物叶际微生物的多样性和群落结构。然而，鲜有研究探讨AM真菌对叶际微生物组的影响。此外，病原菌感染可以改变植物叶际微生物的多样性和群落结构。由于柑橘D. citri 感染后其叶际微生物组发生了变化，受感染叶片中的附生细菌丰富度明显高于未感染叶片。然而，这仅表明病原菌感染可以改变单个植物叶际微生物组的多样性。重要的是，现阶段尚未有研究评估当供体植物感染病害时，CMNs对受体植物的叶际微生物的影响。因此，本研究首次证明病原菌侵染供体植物后，可通过CMNs影响受体植物叶际微生物组的多样性和群落结构。结果表明，供体白三叶感染病原体改变了受体黑麦草的叶际真菌多样性和群落结构。受体黑麦草的叶际细菌群落结构随着CMNs连接而发生显著变化，但不受供体白三叶感染病原菌的影响。叶际微生物的α和 β多样性（尤其是在真菌群落中）的差异表明，CMNs连接可以影响微生物群落，并可能在植物防御病原菌侵染中发挥作用。

CMNs诱导的受体植物叶际微生物组的改变可归因于几个因素。首先，某些细菌，如溶磷细菌和根瘤菌，具有鞭毛运动，使其能够穿过菌丝表面的水膜，通过AM真菌菌丝水膜进行迁移。其次，植物根系和根际是微生物的储藏库，已有研究表明植物根际和根系的微生物可以迁移到植物的地上部分，包括植物叶际。先前的研究表明，AM真菌调节微生物组，可以选择性地从植物根际和菌丝际的周围土壤中组装微生物群落。在本研究中，供体白三叶感染病原菌后，供体和黑麦草之间由CMNs连接的共享真菌ASVs的数量显著增加（图4）。可能的原因是在供体植物感染病原体后，形成了一种独特的根际和菌丝际微生物群。这可能促进了细菌通过菌丝迁移到受体植物的根际和菌丝际，进而改变受体植物菌丝际和根系微生物，从而改变了受体植物的叶际微生物组成和结构。

微生物网络复杂性会影响植物健康。在本研究中，与健康白三叶相比，病原菌侵染后供体白三叶表现出更复杂的微生物网络结构。值得注意的是，与健康白三叶CMNs连接的黑麦草相比，与感染病原菌的白三叶相连的黑麦草中观察到明显更复杂的真菌网络结构。值得注意的是，如图6所示，与无CMNs和与健康白三叶相连的黑麦草相比，与感病白三叶相连的黑麦草中观察到的真菌网络结构明显更复杂。因此，白三叶感染病原菌后，微生物网络的复杂性增加，随后通过CMNs影响邻近的黑麦草，最终增强了黑麦草微生物网络的复杂度，提高了系统的稳定性。CMNs连接下的植物叶际微生物网络表现出更大的复杂性，网络稳定性与网络复杂性密切相关，这支持复杂性促进稳定性的基本生态学原理。另一方面，由于叶际微生物和病植物病原菌共享相似的生态位，在封闭的叶片环境中争夺营养和空间，这极有可能抑制病原菌的进一步侵染。在本研究中，微生物网络复杂性的增加可能与病原菌侵染下CMNs连接的供体白三叶和受体黑麦草之间共享的真菌ASV的显著增加有关因此，这验证了我们关于CMNs改变叶际微生物多样性和群落结构的假设，从而诱导接收植物对病原菌侵染的防御反应。

CMNs改变受体黑麦草叶际微生物，诱导和增强植物对病原菌的抗性

我们随后的分析表明，CMNs会影响受体植物叶际微生物的多样性和组成，这与CMNs诱导的防御信号物质有关。Mantel检验分析表明，真菌ASVs丰度与植物PPO活性呈显著正相关。进一步的相关性分析发现，PPO和CAT活性均与真菌α多样性指数呈正相关。这些结果表明受体植物防御机制的变化可能是CMNs影响邻近植物叶际微生物的另一种途径。研究已经证明了CAT和PPO在植物生长、发育和防御反应中的关键作用，如病原菌侵染植物后，会显著增加植物的PPO和CAT活性，提高植物抗性。且已有研究表明病原菌侵染植物时，AM真菌可增加植物中CAT、PPO和POD等防御酶的活性，从而增强植物对病原菌的抗性。此外，研究证明植物可以从环境中招募有益微生物来增强其对病原菌的防御能力，且植物抗逆性的增强可能是通过叶际微生物诱导植物代谢防御机制来实现的。CAT 和PPO活性与真菌α多样性之间的相关性表明，微生物的变化与防御酶的激活直接相关。

此外，我们还进行了LEfSe分析，以确定不同处理中的特征微生物，特别是与AML-P+相比，NM-L+P+黑麦草中丰度显著更高的属。本研究中，26个属在NML+P+黑麦草中表现出更高的丰度，包括Vishniacozyma。Vishniacozyma 属真菌可以抵抗各种植物病原体，包括病原菌镰刀菌Fusarium、Moniliophthora roreri 、灰葡萄孢菌Botrytis cinerea、 Penicillium expansum和Cladosporium spp.。因此，我们假设Vishniacozyma真菌具有广泛的抗病性。特别是在这项研究中，Vishniacozyma 属在通过CNMs与感病白三叶相连的黑麦草中显著富集，这表明它可能在白三叶-黑麦草系统性抗病性中起关键作用。本研究表明，CAT活性和MDA含量与这些内生菌的相对丰度呈显著正相关，这表明叶际微生物的诱导可能在调节CMNs介导的病原菌防御反应中发挥重要作用，且与植物防御性酶活性息息相关。然而，需要进一步的研究来阐明其与抗氧化酶的特异性相互作用。此外，黑麦草通过CMNs与感染病原菌的白三叶相连会引起受体黑麦草叶际微生物组更为复杂，这需要更多的微生物来实现，然而微生物富集可能导致黑麦草中丙二醛含量的升高。

结  论

本研究表明，CMNs为植物间通讯提供了渠道，使不同物种的植物能够在不直接接触的情况下为病原菌侵染做好准备。总之，CMNs在供体植物感染病原菌后改变了邻近植物的叶际微生物丰度和群落结构，从而进一步增强了邻近植物中的微生物相互作用和网络复杂性。这种激活可能会触发受体植物对潜在病原菌的防御反应，从而增强系统抵抗病原菌侵染的能力。应进行进一步研究，以探索这些由CMNs介导的变化是否会增加相互连接的植物群落的抵抗力，以及这些现象是否可以在自然环境中发生。

方  法

植物和真菌

本研究以白三叶（Trifolium repens L.）和多年生黑麦草（Lolium perenne L.）为植物材料。AM真菌为Funneliformis mosseae （编号 BGCNM02A）。AM真菌接种物由干土、AM真菌孢子、菌丝体和定殖的白三叶根系碎片组成。叶斑病病原菌Stemphylium sarciniforme是从甘肃岷县田间患病的红三叶（Trifolium pratense L.） 中分离出来的。通过形态学评估和分子技术对病原菌进行鉴定（GenBank登录号：PP212851和PP236998）。病原菌S. sarciniforme是白三叶属植物（包括白三叶）的重要叶斑病原菌。

实验设计

实验设计按照Babikova 等人（2013 年）所述进行调整。在 40 cm × 30 cm × 27 cm 的生长室中，供体植物（白三叶）和受体植物（多年生黑麦草）之间建立了两个不同的地下连接方式（图1F）。供体植物种植在生长室中间，接种AM真菌，并进行病原菌处理（P+）或无病原菌处理（P-）。在生长室的两侧放置了两个装有接收植物的花盆。使用直径为5 cm的PVC管连接受体和供体植物，供体植物和接收植物之间的AM真菌菌丝形成的CMNs分为连接（L+），或者不连接（L-）。将生长培养基加入5 cm PVC管中。有两种处理：（1）在第一个处理中，在5 cm的PCV管两侧放置尼龙网（37 µm），这使得供体植物的AM真菌菌丝体能够通过并形成CMNs。受体植物未接种AM真菌（NM-L+）。（2）在第二次处理中，在PCV管两侧放置尼龙网（0.45 µm），阻止AM真菌菌丝通过。因此，该植物无法形成CMNs。在此组中，但受体植物接种了AM真菌（AM-L-）。重要的是，PVC管可防止白三叶和黑麦草的根部的直接接触（图1F）。在温室中共建立了10组实验装置，其中5个是病原菌侵染白三叶，另外5个是无病原菌侵染白三叶。本试验在兰州大学榆中校区草业科技学院温室进行。

生长基质

植物生长基质使用土壤和河沙的混合基质，泥炭土和河沙以1：3（v/v）比例全部混合均匀，然后过2mm筛，然后于121℃高压灭菌2次，每次灭菌1h，间隔24h。土壤混合物中总磷含量为17.66 mg·kg^-1，pH值为7.3。供体植物和受体植物的AM处理使用100 g AM真菌接种物，将其均匀混入每个盆中的土壤中。相比之下，每盆未接种AM真菌处理的盆中装有100 g灭菌的AM真菌接种物，以及不含AM真菌但含有其他微生物的滤液。

温室实验

供试白三叶和黑麦草种子由农业农村部牧草与草坪草种子质量监督检验测试中心（兰州）提供。挑选的多年生黑麦草和白三叶种子用1%NaClO进行表面消毒10 min，用无菌水冲3次后，再用75%酒精消毒3 min，再用无菌水冲洗三次，均匀摆放在铺有双层滤纸的直径90 mm培养皿内，在25℃光照培养箱中催芽，种子露白后播种，最终种植黑麦草5株/盆，白三叶14株/盆。种植10周后，用病原菌S. sarciniforme接种白三叶。接种病原菌方法参照Li等2023的方法。病原菌接种7 d后在白三叶上观察到典型的病害症状（图S15）。开始病原菌处理之前，所有植物均使用聚乙烯塑料罩罩住每盆植物，防止病原菌及挥发性物质对试验的干扰。

植物收获和生理指标测定

病原菌接种后7 d，测量光合相关指标，包括净光合速率（Pn）、细胞间二氧化碳浓度 （Ci）、蒸腾速率 （E） 和气孔导度 （Gs）。从盆中的每株植物上收获白三叶和黑麦草植物叶片。用于测定POD、SOD、CAT、PPO、SA、JA、NO和MDA。此外，约1克叶片样本并进行表面灭菌，以提取DNA并对进行扩增子测序。将剩余的样品并放入信封袋中，干燥并称重。然后计算样品中的水分含量，进而测定茎叶的总干重。收获植物根系并用水清洗。选择并切下约0.5 g细根以检测菌根定植率。将另一部分根放入干燥并称重的信封袋中，干燥并称重。计算根中的水分含量，并测定根的总干重。使用比色分析试剂盒（上海生工生物技术有限公司）测定POD、SOD和PPO活性以及MDA含量。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测SA、JA和NO的含量。

DNA提取和微生物扩增子测序

使用 TGuide S96DNA 试剂盒提取植物 叶片DNA。用Qubit dsDNA HS测定试剂盒和Qubit 4.0荧光计（Invitrogen，Thermo Fisher Scientific，Oregon，USA）测量样品的 DNA 浓度。使用引物335F（5'-CADACTCCTACGGGAGGC-3'）和769R （5'-ATCCTGTTTGMTMCCCVCRC- 3'）扩增细菌16S RNA（rRNA）基因V3–V4区域。使用引物ITS1F（5’-CTTGT CATTTAGAGAAGTAA-3’）和ITS2（5’-GTGCGTTCTTCATCGATGC-3’）扩增真菌ITS1区域。

使用Illumina NovaSeq 6000平台对构建的文库进行测序。使用Trimmomatic（v. 0.33）过滤原始数据以确保高质量的序列数据。使用Cutadapt（v. 1.9.1）识别并去除引物序列。使用USEARCH（v. 10）组装从上述步骤获得的双端（PE）读数，并使用UCHIME（v. 8.1）去除嵌合体。然后对Clean reads进行特征分类，通过DADA2输出ASV。黑麦草每个样本的真菌Clean reads介于285,082和390,488 之间，白三叶真菌Clean reads平均为403,254。黑麦草每个样本的细菌Clean reads介于72,234和79,259之间，白三叶细菌Clean reads平均为73,693。在黑麦草中分别鉴定出平均3,111和6,472个真菌和细菌ASV，在白三叶中分别鉴定出平均1,595和1,701个真菌和细菌ASV（表S3、4）。稀释曲线结果表明测序深度符合数据标准（图S16）。

统计分析

使用R（v. 4.2.0）对受体黑麦草数据进行方差分析（ANOVA）。通过LSD检验确定各处理之间的显著差异（p < 0.05）。使用Student's t检验分析供体白三叶数据。使用QIIME2中的SILVA数据库对ASV进行分类注释。分别使用QIIME2和R计算和可视化alpha多样性。使用QIIME确定beta多样性，利用NMDS可视化beta多样性，然后使用R中的“vegan”包，利用 PERMANOVA评估白三叶和黑麦草ASV的Bray-Curtis距离。此外，使用LEfSe分析来确定各组之间的显著差异微生物。使用Mantel检验分析ASV多样性对酶活性、植物激素和光合指标的影响。使用R中的“ggpmisc”包计算回归分析，并使用“ggplot2”包进行可视化。根据ASV在样本中出现的频率≥3/5，使用ASV数据为每种处理独立创建微生物共现网络。基于Spearman相关系数 > 0.8 或 < 0.8 和p < 0.05的稳健相关性被用于构建网络。我们计算了网络的特征以估计其复杂性，包括节点总数、边数、平均聚类系数和平均度，这些特征值是使用“igraph”包计算的，使用Gephi软件（v. 0.9.7）对网络进行可视化。

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