iMeta | 汤步富/罗鹏/黄昭-靶向SLC7A11增强肝细胞肝癌消融中的免疫反应

靶向SLC7A11通过树突状细胞介导的抗肿瘤免疫反应提高肝细胞肝癌的射频消融疗效

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●  癌症患者经RFA治疗后，TME中SLC7A11/xCT的表达和DC的比例增加；

● SLC7A11/xCT是癌症的不良预后标志物，主要在TME中的DC中表达；

●  靶向DC中的xCT与RFA联合显著增强抗肿瘤免疫，抑制肿瘤生长，改善癌症的治疗结果提供了一种有前景的策略。

引  言

射频消融术（RFA）在临床实践中被广泛用作治疗肝细胞癌（HCC）的成熟方法。它可以在肿瘤内产生高温，诱导肿瘤细胞坏死，同时改变肿瘤微环境（TME）以影响局部免疫反应。然而，作为一种独立的治疗方法，RFA通常会导致较大肿瘤的不完全消融，从而导致肿瘤复发的风险较高。重要的是，RFA产生的肿瘤片段可以引发抗肿瘤免疫反应，这表明将RFA与免疫疗法相结合可能会改善HCC患者的预后。

树突状细胞（DC）作为最有效的抗原呈递细胞，在先天免疫和适应性免疫之间起着至关重要的桥梁作用。在TME中，DC可以捕获和处理肿瘤抗原，将其呈递给T细胞并激活针对肿瘤的特异性免疫反应。研究表明，消融后TME中DC的数量显著上调，特别是在消融部位附近，表明它们在RFA诱导的抗肿瘤免疫中的潜在作用。因此，将RFA与增强DC功能的免疫疗法相结合，可能会进一步增强抗肿瘤免疫反应，改善肿瘤消退。

细胞氧化还原平衡对于抗肿瘤疗效至关重要，靶向氧化应激可以调节免疫细胞功能。SLC7A11编码的xCT蛋白促进半胱氨酸和谷氨酸转运，从而通过细胞内谷胱甘肽合成调节氧化还原平衡。此外，SLC7A11的过表达与各种癌症的预后不良有关，表明其在肿瘤进展和耐药性中起着重要作用。然而，研究主要集中在SLC7A11在肿瘤细胞中的抗氧化和抗铁蛋白作用上，其在TME内免疫细胞中的作用仍然不甚明确。在此，我们使用全面的生物信息学分析和实验验证来研究SLC7A11在癌症免疫微环境中的作用，阐明潜在的调节机制，并对HCC的RFA联合治疗模型提出意见。

结  果

在我们的研究中，我们首先比较了切除前和切除后癌症组织的转录组测序数据。我们的研究结果显示，消融后xCT显著上调（图1A）。免疫细胞浸润分析表明，消融后TME内DC的比例显著增加（图1B和图S1A、B）。相比之下，在基础蛋白表达水平上，xCT在DC中的表达比在肝癌细胞或巨噬细胞中更显著（图S1C）。随后，我们从小鼠体内提取了原代骨髓来源的树突状细胞（BMDC），并对其进行了热处理。我们观察到热处理温度与xCT蛋白表达的升高呈正相关（图S1D）。

基于上述发现，我们推测RFA可以增加DC中xCT的表达。随后，我们建立了皮下癌症小鼠模型，并给予RFA治疗。Western blot分析证实，RFA治疗后皮下肿瘤组织中xCT表达增加（图S1E）。进一步的免疫荧光共定位染色证明，RFA后xCT的上调主要定位于DC（图1C和图S1F）。鉴于高水平的SLC7A11与HCC预后不良之间的相关性（图1D和图S1G），有必要进一步研究SLC7A11/xCT在DC中的作用。

单细胞转录组分析显示SLC7A11在DC中起免疫抑制作用

为了了解SLC7A11在DC中的作用，我们在GSE140228单细胞转录组中提取了癌症患者的正常组织和肿瘤组织，并对其进行了分析。图S2A、B所示的样本分布和组织分布表明，样本的数据整合和批量校正是有效的。在最初的细胞聚类中，我们将所有细胞分为8个簇：CD4T细胞、CD8T细胞、B细胞、NK/NKT细胞、DC、TAM、肥大细胞和单核细胞（图1E）。基于聚类的具体标记如图S2C所示。

我们观察了SLC7A11在免疫细胞群中的表达，发现总体表达不高，但SLC7A11+细胞组成中DC的比例接近70%，表明SLC7A11可能主要通过DC在TME中发挥作用（图1F）。通过标准化分析过程聚类和亚组标记基因比对，我们确定了五个DC亚组，即cDC1、cDC2、pDC、LCs和mregDC（图1G）。聚类的具体标记和每组的前5个基因分别如图S2D、E所示。其中，cDC1高度表达CLEC9A，这与交叉呈现功能密切相关；cDC2高度表达CLEC10A，与T细胞活化密切相关；pDC高度表达LILRA4，与抗病毒感染有关；LCs特异性表达CD207，这与皮肤抗原呈递有关；mregDC高度表达CCR7和LAMP3，它们调节T细胞的活性并在免疫抑制中发挥作用（图S2F）。尽管DC在肿瘤组织和正常组织中的比例没有太大差异，但mregDC似乎仅在肿瘤组织中表达，表明其在肿瘤免疫中的特异性（图S3A，B）。有趣的是，我们发现SLC7A11主要在mregDC中高度表达，在其他类型的DC中表达较低（图1H）。此外，其表达在分化后期上调，可能反映了mregDC在肿瘤微环境中的适应性调节（图S3C）。

为了探索SLC7A11在DC中的作用，我们筛选了有和没有SLC7A11表达的mregDC中的差异表达基因，并进行了基因富集分析。结果表明，上调的基因与细胞对热的反应有关，而下调的基因与DC分化的途径有关（图S3D，E）。此外，细胞通讯分析显示，mregDC在CD80 / CD86通路中表现出很强的相对强度，表明其具有强大的共刺激能力（图S4A，B）。与SLC7A11^-mregDC相比，SLC7A11⁺mregDC显示出较弱的刺激评分和较低的CD80/CD86表达，表明CD4T细胞的激活能力降低（图S4C、D和E）。图S4F、G、H和I显示了CD4T和CD8T细胞亚群的相应配体表达。相关文献报道，在对免疫疗法有反应的癌症患者中，存在一个细胞三联体：CXCL13⁺CD4T细胞和PDCD1⁺CD8T细胞围绕mregDC，而该区域没有Treg细胞，这表明mregDC可以在癌症免疫微环境中发挥积极调节免疫的作用。

图1. RFA上调DC中的xCT，SLC7A11在DC中高度表达

（A） 火山图显示射频消融（RFA）后癌症组织中SLC7A11的上调；（B） 堆叠条形图显示肝肿瘤消融后DC比例增加；（C） 免疫荧光证实RFA后树突状细胞（DC）中xCT表达上调；（D） 跨多个队列的单变量Cox分析将SLC7A11确定为肝细胞癌（HCC）的预后不良标志物；（E） tSNE图描绘了HCC的免疫景观；（F） tSNE和柱状图显示DC中SLC7A11的高表达和DC群体中SLC7A11⁺细胞的最高比例；（G） tSNE图显示HCC中的DCs亚型；（H） tSNE和柱状图显示了mregDC中SLC7A11的高表达和mregDC中SLC7A11⁺细胞的最高比例。

靶向DC中xCT与RFA联合增强抗肿瘤免疫

鉴于RFA后HCC微环境中CD11c和xCT的显著上调以及SLC7A11 / xCT在DC中的潜在免疫抑制作用，我们推测RFA联合靶向DC中的SLC7A11 / xCT将会是一种潜在的联合治疗策略。为了验证这一点，我们设计了敲除DC中xCT的小鼠（CD11c^cre-xCT^fl/fl小鼠）和对照小鼠（xCT^fl/fl小鼠）（图S5）。

首先，我们从xCT^fl/fl小鼠和CD11c^cre-xCT^fl/fl小鼠中提取BMDC，并比较热处理对DC中CD80 / CD86表达的影响。实验结果表明，热处理显著增加了xCT^fl/fl小鼠CD80 / CD86的表达，这种作用在CD11c^cre-xCT^fl/fl小鼠中更为显著（图2A，B）。这表明xCT结合靶向DC的热处理对DC的共刺激能力具有协同作用。为了观察RFA在两组小鼠肿瘤微环境中的总体作用，我们将Hepa1-6细胞皮下接种到xCT^fl/fl小鼠和CD11c^cre-xCT^fl/fl小鼠体内，并用RFA治疗（图2C）。剥离的肿瘤体积、肿瘤生长曲线和肿瘤重量柱状图均显示，RFA治疗后，CD11c^cre-xCT^fl/fl小鼠的肿瘤消退比xCT^fl/fl小鼠更明显（图2D、E、F）。将肿瘤组织切片，进行HE染色和PCNA染色。结果还显示，RFA与靶向DCs的xCT联合使用具有强大的抗肿瘤活性作用（图2G、H、K）。与热处理BMDC的结果类似，在用RFA治疗的CD11c^cre-xCT^fl/fl小鼠的癌症肿瘤中，DC中的CD86表达显著增加（图2I，K）。CD8⁺T细胞是负责杀死肿瘤细胞的主要效应细胞，因此我们进行了CD8免疫荧光染色，以比较CD8⁺T细胞活化的差异。结果显示，RFA显著激活了CD11c^cre-xCT^fl/fl小鼠的CD8⁺T细胞，与仅RFA组、未经治疗的CD11c^cre-xCT^fl/fl小鼠和xCT^fl/fl小鼠相比，CD8表达更高（图2J，K）。

图2. RFA联合靶向DC中的SLC7A11/xCT是一种潜在的抗肿瘤免疫策略

（A-B）流式细胞术显示，BMDCs的热处理增加了xCT^fl/fl小鼠中CD80+和CD86+DCs的数量，对CD11c^cre-xCT^fl/fl小鼠的影响更强。（C） 动物模型示意图。（D） 不同实验组的肿瘤代表性图像显示，与RFA治疗后的xCT^fl/fl小鼠相比，CD11c^cre-xCT^fl/fl小鼠的肿瘤尺寸较小。（E） 肿瘤重量测量进一步证实，与xCT^fl/fl小鼠相比，RFA后CD11c^cre-xCT^fl/fl小鼠的肿瘤负担减轻。（F） 肿瘤生长曲线表明，与xCT^fl/fl小鼠相比，RFA显著减缓了CD11c^cre-xCT^fl/fl小鼠的肿瘤生长。（G） 苏木精-伊红染色（HE）显示，与xCT^fl/fl小鼠相比，RFA治疗的CD11c^cre-xCT^fl/fl小鼠的肿瘤细胞破坏更大，肿瘤细胞密度降低。（H） 增殖细胞核抗原（PCNA）的免疫荧光染色表明，CD11c^cre-xCT^fl/fl小鼠的肿瘤细胞增殖减少，突显了RFA在该组中更强的抗肿瘤作用。（I-J）CD86和CD8染色证实RFA后CD11c^cre-xCT^fl/fl小鼠的共刺激和抗肿瘤免疫反应增强。（K） 荧光定量直方图。（p<0.05；p<0.01，p<0.001）

讨  论

通过综合分析，我们阐明了SLC7A11在DC中的作用，特别是在mregDC中。然而，实验设计包括在所有表达CD11c的DC中全面敲除SLC7A11/xCT，而不是针对mregDC的靶向消融。鉴于SLC7A11主要在mregDC中表达，并可能在观察结果中发挥更重要的作用，尽管如此，这些影响仍可能被脱靶影响所混淆。这构成了我们研究的局限性；因此，实验结果应被解释为反映了SLC7A11在DC功能中的更广泛作用。此外，尽管有证据表明DC中的xCT可以抑制CD80 / CD86的表达，但重要的是要注意，xCT作为转运蛋白，并不直接控制下游蛋白。对共刺激分子表达的影响可能是通过多种途径介导的，这项研究对潜在机制的有限探索是公认的局限性。最后，虽然靶向SLC7A11增强了DC的共刺激潜力，但RFA高温的细胞毒性作用可能会通过损害DC功能来抵消这一点，从而降低其免疫调节能力。因此，结合这两种治疗方法的最佳时间窗需要进一步研究。

因此，未来的研究应致力于开发更有针对性的方法，以进一步探索xCT抑制导致共刺激分子上调的机制。此外，研究应调查结合这两种治疗方法的最佳时间窗口，并探索结合免疫检查点抑制剂的潜在可行性。

结  论

总之，我们的研究强调了靶向SLC7A11联合RFA在增强肝细胞癌抗肿瘤免疫方面的治疗潜力。我们认为，这种方法值得进一步探索，并可能为HCC患者提供更有效的治疗策略。

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“iMeta” 是由威立、宏科学和本领域数千名华人科学家合作出版的开放获取期刊，主编由中科院微生物所刘双江研究员和荷兰格罗宁根大学傅静远教授担任。目的是发表所有领域高影响力的研究、方法和综述，重点关注微生物组、生物信息、大数据和多组学等前沿交叉学科。目标是发表前10%(IF > 20)的高影响力论文。期刊特色包括中英双语图文、双语视频、可重复分析、图片打磨、60万用户的社交媒体宣传等。2022年2月正式创刊！相继被Google Scholar、PubMed、SCIE、ESI、DOAJ、Scopus等数据库收录！2024年6月获得首个影响因子23.8，位列全球SCI期刊前千分之五(107/21848)，微生物学科2/161，仅低于Nature Reviews，学科研究类期刊全球第一，中国大陆11/514！

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