为了表征动物肠道中巨型噬菌体的多样性，我们分析了来自15.24 TB数据集的955个宏基因组，包括牛8.71 TB、马1.96 TB、猪1.25 TB、绵羊2.75 TB和鹿0.56TB。根据以前的报道，我们开发了一个严格的噬菌体检测流程，用于从宏基因组数据集中识别噬菌体。共有1001个长度超过200 kbp的从头组装的重叠群被归类为巨型噬菌体。为了提高后续分析的质量，选择了668个具有高质量（完整性>90%，共378个）和完整（共290个）基因组的非冗余巨型噬菌体，形成高质量的肠道巨型噬菌体动物集。

668个巨型噬菌体基因组分布在5个动物物种中，代表了迄今为止我们报道的肠道巨型噬菌体基因组数量最多的一次。有10个噬菌体的基因组大小>500 kbp，可归类为巨噬菌体。这些巨噬菌体存在于牛、羊、马和猪的肠道中，表明动物肠道可能是一个巨噬菌体宿主。两个经生物信息学验证的环状和完整噬菌体基因组ERR20279001_716809（Houyi_20）和SRR44355611_713556（Houyi_34）的长度分别为716.8 kbp和713.6 kbp，是迄今为止报道的肠道中最大的噬菌体。先前报道的最大肠道噬菌体基因组长度为660 kbp，来自马肠道样本。基因组长度分别为716.8 kbp和713.6 kbp的两种噬菌体都来源于牛的瘤胃宏基因组数据，但两个噬菌体基因组的平均核苷酸同源性（ANI）为93.93%，表明这两个噬菌体是同一属的不同物种，这表明瘤胃可能是巨噬菌体的储存库。668个肠道巨型噬菌体的中位基因组大小为263.28 kbp，远大于IMG/VR和以前的报道。总的来说，这里的基因组集扩展了巨型噬菌体的目录，并为巨型噬菌体生物学提供了丰富的来源。

此外，巨型噬菌体基因组平均编码23个具有预测翻译功能的tRNA基因，其中82.29%具有至少5个tRNA基因。SRR12268561_1_289927（Houyi_39）编码多达68个tRNA，涵盖了蛋白质合成所需的全部氨基酸。有趣的是，一种称为sup-tRNA的抑制因子tRNA由一些巨型噬菌体基因组编码，它可以诱导无义突变的翻译读通。似乎sup-tRNA可能有助于提高应激下噬菌体基因的翻译效率。巨型噬菌体编码的tRNA序列与宿主编码的tRNA序列不同，这可能有助于噬菌体重定向宿主的核糖体以制造更多自己的蛋白质。

随着巨型噬菌体扩大了基因组大小，我们新组装和发表的巨型噬菌体的进化相关性尚不清楚。为了深入了解已发现的668个巨型噬菌体的分类信息，我们利用了最新的Imphared数据库（2024年9月1日）的DIAMOND BLASTp。在用vContact2和Graphanazyler处理blastp结果后，我们发现只有7个巨型噬菌体基因组被归类为已知科（1个Intestiviridae、1个 Kyanoviridae和5个Steigviridae），其余的只能分配给Caudoviricetes。这些发现强调了我们新发现的巨型噬菌体的新颖性，但也突出了它们分类的挑战。

由于噬菌体常用的分类标记基因不能覆盖所有组，因此通常可以根据基因内容进行初步分组。生成一个包括668个巨型噬菌体和已发表的噬菌体的网络，以对新组装的巨型噬菌体进行分组，这显示了它们的新颖性。为了进一步研究它们的进化关系，我们使用主要衣壳蛋白（MCP）和终止大亚基（TerL）构建了系统发育树（图1）。在668个巨型噬菌体中，143个同时具有MCP和TerL，291个至少具有其中一种。这里报道的巨型噬菌体的蛋白质在高度指导支持下聚集良好，从而定义了进化分支。大多数巨型噬菌体属于MCP和TerL树的5个分支之一。我们将这5个巨型噬菌体分支命名为Kuafu_Jumbo噬菌体、Houyi_jumbo噬菌体、Jingwei_jumbo噬菌体、Pangu_jumbo噬菌体和Zhurong_jumbo噬菌体（根据中国传统神话中的人物）（图1）。在每个分支中均包含从世界不同国家的不同动物中恢复的噬菌体，这表明这些巨型噬菌体在肠道环境中多样性。来自不同动物肠道的巨噬菌体聚集到同一个分支中，表明动物肠道中的巨噬菌体可能共享它们的祖先。此外，在Zhurong_jumbo噬菌体分支中没有发现典型的病毒MCP序列。

预测病毒的宿主对于理解病毒与宿主的相互作用非常重要。我们使用CRISPR间隔区靶向来检测宿主和巨型噬菌体之间的门水平连接。我们从动物肠道微生物组组装的宏基因组组装基因组（MAG）中提取了265,818个CRISPR间隔区。我们检测到127个新组装的巨型噬菌体和10个细菌门之间的10个联系。拟杆菌门和芽孢杆菌门是巨型噬菌体最常见的宿主门（图1）。

考虑到NAD⁺在各种生物过程中的关键作用，包括DNA复制、DNA修复和所有生物体的氧化还原反应，NAD⁺可能对NAD巨型噬菌体的生命周期非常重要。我们对NAD巨型噬菌体进行了全基因组功能注释。我们的NAD巨型噬菌体编码15种消耗NAD⁺的酶（总共222种NAD依赖性酶或NAD辅因子）。这些消耗NAD的酶可能参与DNA复制、DNA修复和NAD⁺介导的反防御，这表明NAD巨型噬菌体可能通过表达自己的NAD依赖性酶来介导各种生物合成过程（图3）。值得注意的是，超过50%（90/174）的NAD巨型噬菌体含有NAD依赖性DNA连接酶，这是DNA复制和修复所必需的酶。更重要的是，这些NAD巨型噬菌体还编码几乎所有与复制相关的基因，包括DNA拓扑异构酶、DNA解旋酶、DNA聚合酶家族、DNA引物酶RNase H1和NAD依赖性DNA连接酶（图3）。它们是原核生物中DNA复制起始和延伸的关键，噬菌体可能使用这些蛋白质将DNA生物合成转向噬菌体自身复制。因此，除了可能独立合成NAD⁺外，NAD巨型噬菌体还可以表达自己的NAD依赖性酶和复制机制，以指导细菌宿主中的噬菌体自我复制。

同样，DNA修复也可能针对细菌宿主中噬菌体自身的修复需求，因为许多NAD巨型噬菌体携带基因，包括DNA损伤传感器PARP1（NAD依赖型）、错配识别因子MutS，以及切除修复酶Vsr和ERCC3（图3）。MutS和NAD依赖性PARP1都可以启动各种形式的DNA修复。Vsr核酸内切酶和ERCC3在核苷酸切除修复中发挥作用，这两种酶可能用于切割噬菌体基因组中错配的DNA。噬菌体密封的NAD依赖性DNA连接酶在DNA修复途径的最后阶段在基因组中缺口。NAD巨型噬菌体可以共同使用它们自己的NAD⁺产物、NAD依赖性酶和关键的修复相关因子来指导宿主的自我修复。

此外，值得注意的是，许多NAD巨型噬菌体编码NAD依赖性酶基因，例如UDP-葡萄糖6-脱氢酶（UGDH）、UDP-葡萄糖4-差向异构酶（galE）和dTDP-葡萄糖4,6-脱水酶（rfbB），参与脂多糖（LPS）生物合成（图3）。细菌LPS是一种丰富多样的细胞壁多糖，被噬菌体用作感染受体。噬菌体编码的LPS合成可能能够改变细胞壁的修饰，以防止竞争性噬菌体的感染。通过修饰宿主细胞壁，可以提高NAD巨型噬菌体的生存适应性。

来自巨型噬菌体的NAD⁺的另一个功能可能是抵消由NAD⁺耗竭介导的细菌流产感染防御。有研究表明在抗噬菌体防御系统中，由Sir2结构域触发的NAD⁺耗竭会导致细菌自杀以限制噬菌体增殖。NAD巨型噬菌体含有多种参与NAD⁺挽救性合成途径的基因，而这些基因在其宿主中是不存在的（图2A），这意味着NAD⁺可能由NAD巨型噬菌体自主合成。来自NAD巨型噬菌体的NAD⁺可用于维持宿主和噬菌体繁殖的正常NAD⁺水平，从而抵消宿主NAD⁺的消耗。这表明在巨型噬菌体中合成NAD⁺的能力可能是针对宿主NAD⁺消耗的反防御策略，尽管这需要进一步的实验验证。

NAD巨型噬菌体跨越了来自世界不同国家的五种动物物种，提醒我们NAD巨型噬菌体的生态系统分布不同。为此，我们进一步分析了NAD⁺合成基因途径是否存在于人类相关和环境相关的巨型噬菌体中。在来自人类和自然环境微生物组的863个巨型噬菌体中，我们鉴定了181个具有完整NAD⁺合成途径的大型噬菌体，它们属于NAD巨型噬菌体。我们确定了这些NAD巨型噬菌体在地球生态系统中的分布，包括培养的噬菌体、人类相关样本（肠道和口腔）和环境相关样本（淡水湖泊和河流、海洋生态系统、沉积物、温泉、土壤、深层地下栖息地和建筑环境）（图4A）。NAD巨型噬菌体已在不同的细菌宿主上被分离和培养，这表明在我们的研究中鉴定这种NAD⁺合成途径并不是宏基因组分析的人为因素。

与动物相关的NAD巨型噬菌体类似，环境和人类相关的NAD巨型噬菌体还包括NR挽救途径、NAM挽救途径或Preiss途径，显示了跨生态系统的NAD⁺合成途径的多样性。我们通过对两种NAD⁺合成限速酶（NAMPT和nadD）序列进行系统发育分析，进一步表征了NAD⁺合成基因的多样性。在大多数情况下，来自同一生态系统类型的NAD⁺合成酶的系统发育显示出紧密的聚集性，这支持了先前的发现，即噬菌体代谢酶与环境温度和营养相关，以增强噬菌体的环境适应能力。在少数情况下，人类相关噬菌体的NAD⁺合成酶系统发育与动物相关噬菌体的NAD⁺合成酶系统发育显示紧密聚集，可能的解释是NAD巨型噬菌体发生在动物和人类之间的水平基因转移。尽管NAD⁺合成基因在生态系统中多种多样，但RoseTTAFold预测的蛋白质结构和NAMPT和nadD的保守氨基酸残基与通过冷冻电子显微镜测定的细菌一致（图4C）的此外，Lee等人报道了弧菌噬菌体KVP40编码功能性NAMPT蛋白和nadD蛋白，用于体外NAD⁺合成。AutoDock Vina结果表明，来自NAD巨型噬菌体和KVP40噬菌体的NAMPT蛋白对其底物NAM均具有高结合亲和力；来自NAD巨型噬菌体和KVP40噬菌体的nadD蛋白对其底物NMN都有很高的结合亲和力。除了NAD⁺的合成基因外，与环境和人类相关的NAD巨型噬菌体还携带参与DNA复制、DNA修复和反防御的消耗NAD⁺的酶基因，这与在动物肠道中发现的一致。对于人肠道中的NAD巨型噬菌体，这些噬菌体的宿主主要集中在拟杆菌门中。人类微生物组中的NAD巨型噬菌体与其宿主具有互补的NAD⁺合成途径。总的来说，噬菌体编码的NAD⁺合成和利用系统广泛分布在地球的生态系统中，并可能在各种环境中帮助巨型噬菌体发挥作用。

我们的研究表明，NAD巨型噬菌体广泛分布在地球的生态系统中。我们已经成功组装了总共1001个巨型噬菌体基因组。其中668个为非冗余的高质量或完整巨型噬菌体基因组，是迄今为止质量最高、数量最多的巨型噬菌体基因组资源。通过整合来自公共数据库和先前报告的863个巨型噬菌体基因组，我们形成了全球巨型噬菌体数据库（JumbophageDB），其中包含跨生态系统的1864个病毒基因组。根据ICTV的分类标准，VIRIDIC软件的分析结果显示，JumbophageDB共包含1317个属级簇和1680个种级簇。该资源进一步扩展了其他数据库中未发现的未探索的病毒多样性，它将提高微生物组中病毒读数的检测，并可能有助于研究它们在肠道健康和自然环境中的作用。

据报道，噬菌体弧菌KVP40编码的NAMPT显示出最高的活性，与来自不同来源的真核生物和原核生物的8个NAMPT相比，NAD⁺前体（NMN）的产生增加了3倍。NMN作为一种有效的抗衰老产品，可以提高人类NAD⁺水平，改善NAD⁺随年龄增长而降低的有害影响，显着延长寿命并改善与年龄相关的并发症。KVP40编码的NAMPT已用于在工程细菌中大规模生产NMN。NAD巨型噬菌体包括71个NAMPT和其他数百个NMN合成基因（nadR，nadM，nadD），它为通过基因工程细菌或酵母产生活性NMN提供了有价值的基因库。

NAD巨型噬菌体具有扩展的遗传库，包括通过挽救途径和Preiss-Handler途径而不是从头途径合成NAD⁺所需的所有酶基因。这似乎与挽救途径和Preiss-Handler途径合成，NAD的高效率有关。两项研究报道，NAD⁺合成的噬菌体编码的酶在体外和细菌中表现出高生物活性，这意味着NAD巨型噬菌体可能在宿主中合成真正的NAD⁺。此外，NAD巨型噬菌体还编码至少15种参与DNA复制、DNA修复和反防御的消耗NAD⁺的酶基因，这表明噬菌体有能力将NAD⁺代谢重定向到细菌宿主中的噬菌体繁殖需求。NAD⁺代谢的重塑与感染古细菌和蓝细菌的病毒的研究结果一致，这些病毒重定向化学能（ATP）合成以增加病毒的产生。NAD巨型噬菌体的重塑代谢可能代表一种针对细菌宿主的生存策略或反防御系统，可用于改善人类和动物的健康。例如，配备NAD⁺合成途径的噬菌体可用于调节肠道微生物组或杀死耐药细菌。

许多NAD巨型噬菌体的宿主是拟杆菌，它们是动物和人类肠道中的主要共生菌，表明NAD巨型噬菌体可能是肠道微生物组的重要组成部分。此外，NAD巨型噬菌体与其在动物和人类肠道中的细菌宿主补充了NAD⁺合成途径，这意味着NAD巨型噬菌体可能会影响肠道细菌甚至哺乳动物细胞的NAD⁺合成。最近的研究报道了肠道微生物组和哺乳动物细胞之间NAD⁺合成的跨王国合作，其中肠道微生物群促进了哺乳动物宿主的NAD生物合成，这表明这种相互作用在NAD⁺介导的抗衰老或抗肿瘤中起重要作用。因此，本研究中发现的NAD巨型噬菌体与肠道核心细菌（如Bacteroidota）之间的代谢相互作用对NAD⁺介导的人类健康具有一些重要意义。首先，为了提高组织中NAD⁺水平以对抗人类衰老，未来的研究需要考虑肠道噬菌体 NAD⁺代谢对哺乳动物NAD⁺生物合成的影响。其次，肠道细菌的NAMPT或pncA表达促进哺乳动物NAD⁺合成，这可能导致肿瘤细胞耐药和肿瘤细胞存活或迁移。因此，噬菌体编码的NAMPT或pncA基因可能会影响肿瘤微生物组中微生物介导的耐药性。值得注意的是，尽管已经进行了大规模的宏基因组数据分析并鉴定出相当数量的巨型噬菌体基因组，但可用的巨型噬菌体基因组的总数仍然有限。这限制了我们探索和深入了解巨型噬菌体的其他保守特征和不同功能的能力。特别是，本研究中提出的结果和结论基于使用生物信息学工具进行的分析。NAD⁺在巨型噬菌体中的合成和利用需要进一步的实验验证。

总体而言，人们对巨型噬菌体的了解仍然很差，我们扩展的高质量巨型噬菌体为巨型噬菌体生物学提供了重要的资源。Al-Shayeb等人认为，巨型噬菌体与小噬菌体完全不同，更类似于共生细菌，模糊了活体和非活体之间的区别。我们的研究结果强化了这一点，因为生命的特征之一是能够产生代谢能量（例如NAD⁺）来维持自身。总之，我们对NAD巨型噬菌体的研究为生命进化和噬菌体-宿主相互作用提供了更深入的理解。