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梯度洗脱想必大家都不陌生，是色谱分离中广泛应用的一种方法，特别适用于反相色谱和离子交换色谱。在梯度洗脱中，通过逐步增加流动相中强溶剂（通常称为B溶剂）的比例，可以提高分析物的洗脱强度，实现难以分离组分的良好分离效果。然而，梯度洗脱的成功实施需要考虑多种因素，本文将探讨使用梯度洗脱时的关键注意事项。
一、选择梯度洗脱的条件
在分离条件不明的情况下，梯度洗脱通常是首选，因为它能够涵盖较大的洗脱范围，有助于观察不同组分的分离效果。通常，梯度洗脱的B溶剂从10%增加到100%，以线性方式进行。然而，值得注意的是，在反相色谱中通常不建议使用100%的流动相A（弱溶剂），因为这可能导致键合烷基链的塌陷，从而影响分离效果和柱效。
决定使用等度模式还是梯度模式的关键在于色谱峰占据梯度分离时间的比例：
色谱峰占据梯度时间超过25%：梯度洗脱效果较好，甚至是唯一的选择。在这种情况下，可以考虑将B溶剂的比例范围缩小，不一定需要从10%到100%。（如图1上半部分所示）
色谱峰占据梯度时间低于25%：建议尝试等度分离。这种情况下，可以从色谱图中估算出B组分的最佳比例以实现分离。（图图1下半部分所示）
图 1. 梯度曲线的起始延迟来自系统的死体积。色谱图来自计算机模拟
二、优化分离的选择性
在某些情况下，需要对色谱的分离选择性进行优化，包括选择不同的固定相类型、B溶剂、流动相添加剂以及操作温度等。此外，梯度的形状（例如线性、凸形、凹形）也可能影响分离效果。尤其在分析不同保留强度的组分时，适当的梯度曲线形状（如凹形梯度）可以显著提高分离效率。这是因为凹形梯度在洗脱初期只增加少量B溶剂即可大幅度提升洗脱强度，更适合那些洗脱强度差异较大的分析物。
图 2. 常见的梯度轮廓形状。
三、防止鬼峰的出现
在梯度洗脱中，鬼峰（或假峰）是一种常见现象，通常是由于流动相不纯所致。如果流动相中的杂质吸附在色谱柱顶部，随梯度的进行，这些杂质会被B溶剂逐步洗脱，从而形成不可预测的鬼峰。这种情况可以通过以下措施来避免：
使用高纯度的溶剂，确保流动相A和B中无杂质。
定期维护仪器，清洁色谱柱和管路，防止杂质积累。
例如，在图3中，采用了不纯净的乙腈和水作为流动相A和B，结果导致在不进样的情况下出现了鬼峰。这表明溶剂的纯度对梯度洗脱的效果至关重要。
图 3. 溶剂不纯导致梯度洗脱中出现鬼峰。
四、确定合适的梯度轮廓和时间
梯度洗脱的另一关键在于梯度轮廓的设计和梯度时间的控制。梯度轮廓可以是线性的、凹形的、凸形的等，选择适合的梯度轮廓能够改善分离效果。例如，如果两个分析物的洗脱强度差异较大，凹形梯度能够在初期提供更强的洗脱强度，从而改善分离效果。此外，梯度间隔时间的设定也非常重要，需要根据经验和实验进行调整。若条件允许，可以借助计算机模拟来优化梯度条件，以提升分离效率。
五、梯度洗脱后的再平衡
在完成梯度洗脱后，色谱柱需要再平衡，使流动相恢复至初始条件。对于使用化学键合相的色谱柱，再平衡较为简单，只需泵送五倍柱体积的起始流动相即可。然而，死体积较大的色谱系统可能需要更长的再平衡时间，以确保柱内的溶剂成分均一，从而保证下次进样的重复性。
六、检测器的选择
在梯度洗脱中，某些检测器并不适用。尤其是吸附柱模式，梯度洗脱通常不推荐使用，因为吸附柱对于流动相成分变化较为敏感。另外，示差折光检测器和电导检测器在梯度洗脱中效果较差。这些检测器易受到流动相成分变化的影响，导致基线漂移或信号波动。因此，在梯度洗脱中，应优先选择UV检测器等对流动相成分变化不敏感的检测器。
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