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紫外-可见光检测器(UV-Vis)
UV-Vis 检测器的原理是通过待测物在检测器流通池中吸收紫外-可见光的多少来确定其含量,服从朗伯比尔定律,是液相色谱应用最早、最广泛的检测器。在液相色谱中的应用超过80%,因其对温度、流速、风度、湿度、振动等的变化相对不敏感,且灵敏度高。即可测 190~350 nm(紫外光区)的光吸收变化,也可向可见光 350~700 nm 范围延伸,直到现在几乎所有的液相色谱仪都配有这种检测器。理论上讲,只要待测物分子中含有发色基团(光吸收性强的基团,与分子的外层电子或价电子有关),能够吸收紫外-可见光,就可以考虑用 UV-Vis 检测器检测。此外,对于有紫外吸收的如 F-、Cl-、Br-、NO2 -、NO3 -、SO4 2-等无机阴离子也可用 UV 检测。
缺点不多,个人认为最大的缺点只有两个:一个是样品必须有紫外吸收,另外一个就是对流动相有一定的要求,流动相的紫外吸收应尽可能的小,否则会有较大的本底吸收。本底吸收也是截距的一大来源,样品的响应等于本身的吸收减去流动相本底吸收,如果本底吸收为固定值b的话,样品在仪器上实际的响应者为A=kc-b。流动相的影响在有关物质检测中较为明显,因为杂质量小,响应弱,流动相的影响就较大,这个需要注意。就是说开发方法时检测波长应尽可能大于流动相的截止波长。
是目前液相色谱灵敏度最高的检测器,应用广泛,选择性强。适用于能激发荧光的化合物。很多与生命科学有关的物质,如氨基酸、胺类、维生素、甾族化合物及某些代谢药物都可以用荧光法检测。荧光检测器在生物样品痕量分析中具有重要作用,尤其在用荧光衍生后,可以检测很微量的氨基酸和肽。在实验过程中需要严格脱气,因为系统中残留的氧气会引发荧光淬灭反应,造成峰面积大幅下降甚至不出峰。一般情况下,荧光检测器的灵敏度比紫外检测器约高2个数量级,但其线性范围不如紫外检测器宽。近年来,采用激光作为荧光检测器的光源而产生的激光诱导荧光检测器极大地增强了荧光检测的信噪比,因而具有很高的灵敏度,在痕量和超痕量分析中得到广泛应用。
示差折光检测器(RID)
是一种通用型检测器,利用物质的折光效应,对所有物质均有响应,只要被测组分与洗脱液的折光指数有差别就可使用。示差检测器是基于连续测定样品流路和参比流路之间折射率的变化来测定样品含量的。光从一种介质进入另一种介质时,由于两种物质的折射率不同就会产生折射。只要样品组分与流动相的折光指数不同,就可被检测,二者相差愈大,灵敏度愈高。在一定浓度范围内检测器的输出与溶质浓度成正比。
生命科学中常遇到各类糖类化合物、脂肪烷烃等,没有紫外吸收,一般常用示差折光检测器。它的通用性比UVD广,但灵敏度要低,对温度变化敏感,是所有检测器中对温度要求最高的。另外,不同的流动相比例,其密度或者折光系数不同,如果流动相比例发生改变,则会引起基线的持续变化,因此示差折光检测器只能采用等度洗脱,不能采用梯度洗脱,这也限制了它的使用。
优点是通用,没有不能检测的。
最大缺点:灵敏度低,一般来说有关物质检测不能用它,RID一般用于含量测定;另一个缺点由它的原理决定,只能等度,所以多组分的分离存在问题。还有平衡时间过长,对环境要求高(尤其是室温的波动)也是让操作人员困扰的因素。
蒸发光散射检测器(ELSD)
也是一种通用型的检测器,原理是利用光散射效应,可检测挥发性低于流动相的任何样品,通过雾化器去除溶剂,让化合物形成悬浮颗粒,从而形成散射效应。ELSD灵敏度比RID高,对温度变化不敏感,基线稳定,可用于梯度洗脱,并且可在没有标准品和化合物结构参数未知的情况下检测未知化合物,但不能使用不挥发的盐类溶剂,而要用醋酸铵之类的挥发性缓冲盐来代替。现在ELSD已被广泛应用于碳水化合物、类脂、脂肪酸和氨基酸、药物以及聚合物等的检测。适用于分析没有紫外吸收的有机物质,尤其在没有标准品和化合物结构参数未知的情况下检测未知化合物。ELSD的响应不依赖与样品的光学特性,任何挥发性低于流动相的样品均能被检测,且对温度变化不敏感,基线稳定,适合与梯度洗脱液相色谱联用。
ELSD运行有三个过程:第一是雾化过程,用惰性气体或净化空气将色谱柱流出物雾化;第二是蒸发过程,在一个加热管(漂移管)中将流动相挥发;第三是检测过程,测定留下来的样品颗粒的光散射。所有商品ELSD都由一种或两种模式完成这三个过程。模式A的操作是全部柱流出物(气溶胶)都进入直的漂移管,让流动相在其中蒸发,模式B中是将气溶胶通过一个弯管,在此管中大的颗粒沉积下来流入废气管,其余的小颗粒进入螺旋状的漂移管,在上述两种模式中,样品颗粒均进入光管,使激光发生散射而得以检测。
化学发光检测器(CD)
化学发光检测器是近年来发展起来的一种快速、灵敏的新型检测器,因其设备简单、价廉、线性范围宽等优点。其原理是基于某些物质在常温下进行化学反应,生成处于激发态势反应中间体或反应产物,当它们从激发态返回基态时,就发射出光子。由于物质激发态的能量是来自化学反应,故叫作化学发光。当分离组分从色谱柱中洗脱出来后,立即与适当的化学发光试剂混合,引起化学反应,导致发光物质产生辐射,其光强度与该物质的浓度成正比。该检测器不需要光源,也不需要复杂的光学系统,只要有恒流泵,将化学发光试剂以一定的流速泵入混合器中,使之与柱流出物迅速而又均匀地混合产生化学发光,通过光电倍增管将光信号变成电信号,就可进行检测。这种检测器的最小检出量可10-12g。
质谱检测器(MSD)
也是一种通用型检测器,在灵敏度、选择性、通用性及化合物的分子量和结构信息的提供等方面都有突出的优点。但它的昂贵操作费用和复杂性在一定程度上限制了它的推广应用。理解了这些检测器的原理可以帮助我们在实验中更好地选择和使用检测器,更高效率地完成检测任务。
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来源|实验室经理人、实验与分析、制药工艺与装备、网络资料整理