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再不学蛋白质组学就晚啦！

小编教你一文拿下蛋白组学！

——萧忆

蛋白质翻译后修饰（PTM）概述

在生物体内，DNA中的遗传信息首先被转录成RNA，然后再由RNA翻译成蛋白质。然而，这仅仅是蛋白质生命周期的开始。许多蛋白质在翻译成氨基酸序列后，还需要经过一系列的加工和修饰，这些过程统称为蛋白质翻译后修饰（PTM）。PTM通过在蛋白质的一个或多个氨基酸残基上添加或去除化学基团，从而改变蛋白质的物理化学性质，进而影响其功能。

磷酸化修饰详解

磷酸化是PTM中最常见且研究最深入的一种形式。它涉及到一个酶（通常是蛋白质激酶）催化ATP的磷酸基团转移到目标蛋白质氨基酸残基上的过程。根据被磷酸化的氨基酸残基不同，磷酸化蛋白质可以分为四类，但其中O-磷酸盐蛋白质，即磷酸基团连接到肽链中的酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸残基上的蛋白质，是研究得最多的。

磷酸化的重要性

磷酸化修饰在细胞调控中起着至关重要的作用。它像是一个“开关”，能够迅速且可逆地调节蛋白质的活性。当蛋白质被磷酸化时，其构象可能发生变化，进而改变其与其他分子的相互作用能力，或者使其获得新的功能。这种调节机制使得细胞能够对外界刺激做出快速响应，并维持内部环境的稳定。

磷酸化与疾病的关系

由于磷酸化在细胞调控中的核心地位，其异常与多种疾病的发生和发展密切相关。例如，在慢性髓系白血病中，BCR-ABL融合蛋白的磷酸化激活是疾病发生的关键步骤；在乳腺癌、非小细胞肺癌等癌症中，特定蛋白质的磷酸化状态变化与肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力密切相关；在心血管疾病和阿尔茨海默症等神经退行性疾病中，磷酸化修饰的异常也参与了疾病的发生和发展过程。

好的，现在我将结合您提供的材料，对乙酰化修饰、糖基化修饰和泛素化修饰进行汇总整理，并以通俗易懂的方式为您讲解。

乙酰化修饰

定义与类型

乙酰化是一种常见的蛋白质翻译后修饰（PTM），最早在1963年被发现。它主要通过在蛋白质的特定氨基酸残基上添加乙酰基团来改变蛋白质的性质。乙酰化修饰主要有三种类型：

赖氨酸乙酰化：这是最常见的乙酰化类型，发生在蛋白质的赖氨酸残基上。乙酰化酶和去乙酰化酶分别催化乙酰化和去乙酰化过程，使这一过程可逆。乙酰化可以中和赖氨酸的正电荷，从而改变蛋白质与其他分子的相互作用，影响其酶活性、亚细胞定位和DNA结合能力。

N-末端乙酰化：发生在蛋白质的N-末端区域，对蛋白质的合成、稳定性和细胞定位有重要影响。

O-乙酰化：较少见，发生在丝氨酸或苏氨酸的羟基侧链上。虽然也是可逆的，但仅在少数真核生物中检测到。

生物学意义

乙酰化修饰在细胞调控中扮演重要角色，与多种疾病的发生和发展密切相关。例如，蛋白质的乙酰化与胰腺癌、乳腺癌、肺癌、白血病和脑部肿瘤等多种癌症有关。

糖基化修饰

定义与类型

糖基化是蛋白质翻译后修饰中最多样化的一种。它涉及将糖基（碳水化合物）连接到蛋白质的羟基或其他官能团上。根据连接方式和位置的不同，糖基化可以分为多种类型，主要包括N-糖基化、O-糖基化、C-糖基化和GPI（糖基磷脂酰肌醇）锚定。

生物学意义

糖基化修饰对蛋白质的功能和稳定性有重要影响。不同类型的糖基化在细胞识别、信号传导、免疫应答等方面发挥不同作用。此外，糖基化修饰的异常与多种疾病相关，如Walker-Warburg综合症、肌张力障碍综合征、血友病、肺癌、前列腺癌等。

泛素化修饰

定义与过程

泛素化是一种关键的蛋白质翻译后修饰机制，涉及将小分子蛋白质泛素通过酶促反应共价连接到靶蛋白上。这一过程由三种酶（E1激活酶、E2偶联酶和E3连接酶）依次催化完成。泛素化不仅影响蛋白质的定位、代谢和功能，还参与细胞周期、增殖、凋亡等多种生命活动的调控。

生物学意义

泛素化在细胞调控中起着至关重要的作用，是蛋白质降解的主要途径之一。通过泛素化，细胞可以精确控制蛋白质的数量和活性，从而维持内部环境的稳定。此外，泛素化还与多种疾病的发生和发展密切相关，如癌症、代谢综合征、神经退行性疾病、自身免疫疾病、炎症疾病、感染和肌肉营养不良等。

总结

它们通过不同的机制改变蛋白质的性质和功能，在细胞调控和疾病发生中发挥着重要作用。了解这些修饰机制有助于我们更深入地理解生命活动的本质和疾病的发病机制，为疾病的诊断和治疗提供新的思路和方法。

蛋白质定性技术

一、蛋白质定性分析：

    蛋白质定性分析通常是指利用质谱法进行蛋白质鉴定和序列分析，即确定样品中是否有蛋白质存在，以及存在的是何种蛋白质。

    基于MS的蛋白质组学定性分析可以根据MS分析的蛋白质大小分为Top-down分析和Bottom-up分析两种策略（如图1）。Bottom-Up是指通过分析由蛋白质酶解生成的肽段来鉴定蛋白质。当应用该策略来分析蛋白质组混合物时，因其类似于基因组测序的鸟枪法，所以又被称为鸟枪法蛋白质组学（Shot-gun Proteomics)。Top-down直接鉴定完整蛋白质，在翻译后修饰和蛋白质同素异构体鉴定方面有一些潜在的优势，可是该策略的缺陷是蛋白质在气相中分离、电离及碎裂都十分困难；而Bottom-up由于将蛋白质酶解成肽段，使其在气相中更容易被分离、电离和碎裂。目前，Bottom-up分析策略被更广泛地应用于蛋白质定性分析工作。

蛋白质组学的两种基本研究策略

1.技术原理

    其基本原理是利用采集到的二级质谱的离子峰分布来鉴定样品中的肽段，进而鉴定蛋白种类。样本类型主要为胶点、胶条、IP/CO-IP/Pull-down 蛋白溶液等。单纯从质谱的采集上来看，胶点/胶条蛋白鉴定的质谱上机技术和label-free是一样的，都是在DDA模式下采集MS数据时，检测肽段然后立即逐个选择进行碎裂，从而可以在数据分析中匹配其序列。“自下而上”是指利用分析软件从实验肽段和理论肽段谱图匹配推断出有关蛋白质的信息。在这种类型的研究中，蛋白质从样品中提取，然后使用一种或多种酶“消化”成蛋白质片段，称为肽段。然后通过质谱分析，长度为7-30个氨基酸的肽最适合分析。一般胶点胶条蛋白种类比较简单，所以质谱上机时长一般比label-free少，鉴定的蛋白数量一般也是比label-free少。

J. Proteome Res. 2023, 22, 7, 2151-2171

2.技术路线 

IP/CO-IP/Pull-down蛋白溶液相互作用谱

3.应用方向

二、蛋白质组学送样要求：

1、定性蛋白质组

2、定量蛋白质组

备注：以上是常规检测样品需要量，微量样品也可进行蛋白质组检测，但是蛋白鉴定数量没有常规样品的数量多。蛋白质组微量样品要求如下：动物常规组织1-5mg以上，细胞500-10万细胞以上就可以进行检测，微量样品建议选择label-free或DIA检测技术。

白话蛋白质互作IP/Co-IP/Pull-down差别在哪

免疫沉淀（IP）

想象一下你有一堆珠子，其中有些珠子是特殊的，它们上面涂了一种能“抓住”特定颜色小球（比如红色小球）的胶水。免疫沉淀就像这个过程，但这里的“珠子”是抗体，“小球”是我们要找的蛋白质（靶蛋白）。抗体能特异性地识别并结合靶蛋白，就像胶水粘住小球一样。然后，我们通过一些方法（比如离心）把这些结合了靶蛋白的抗体“珠子”沉淀下来，从而把靶蛋白从混合物中分离出来。这样，我们就可以富集和检测这个特定的蛋白质了。

免疫共沉淀（Co-IP）

免疫共沉淀是免疫沉淀的升级版。这次，我们不仅要找红色的“小球”（蛋白A），还想看看它是不是和蓝色的“小球”（蛋白B）手拉手站在一起。我们同样用抗体“珠子”去“抓”红色的蛋白A，但因为蛋白A和蛋白B是好朋友，它们总是粘在一起，所以当我们把蛋白A拉下来的时候，蛋白B也被一起带下来了。这样，我们就知道了蛋白A和蛋白B在体内是有相互作用的。但是，我们不知道它们是直接手拉手，还是通过其他“小球”（可能是第三个蛋白）间接相连的。

Pull-down

Pull-down技术更像是一个精心设计的游戏。我们提前准备一个“诱饵”——一个已经纯化并带有特殊标签（比如GST标签）的蛋白，这个蛋白就像是一个有磁力的“钓鱼钩”。然后，我们把这个“钓鱼钩”放到蛋白质混合物中，看看哪些蛋白会被它吸引过来并“钩”住。这种方法非常直接，能证明两个蛋白之间有直接的相互作用。但是，它也有局限性，因为这是在实验室条件下进行的，不一定能完全反映蛋白质在真实生物体内的相互作用情况。

总结

·IP：专门找并抓住一个特定的蛋白质。

·Co-IP：看两个蛋白质是不是好朋友，总是粘在一起，但不确定是直接还是间接。

·Pull-down：用一个已知的“钓鱼钩”蛋白去钓其他蛋白，看它们是否直接相连，但结果可能不完全反映生理条件。

·IP的作用是富集和检测某单一蛋白，而Co-IP的作用是检测两个蛋白是否在体内有相互作用，但是不能确定是直接或间接相互作用。但IP和Co-IP实验都是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础，是处于天然构象状态的抗原（蛋白样品）和抗体之间的反应。Pull-down与Co-IP的不同之处在于其利用1个纯化且含有标签的蛋白作为诱饵来结合互作蛋白，通常用来证明蛋白之间直接的相互作用。Co-IP则采用固定的抗体捕获互作蛋白，用来证明两个蛋白之间的相互作用，但是不排除通过第三个蛋白介导的间接互作。

蛋白质组学及其定量分析方法综述

引言

蛋白质组学作为后基因组时代的重要研究领域，旨在全面解析生物体内所有蛋白质的表达、修饰、互作等特征，为理解生命过程、疾病机制及药物研发提供重要信息。随着生物质谱技术的飞速发展，定量蛋白质组学已成为该领域的关键分支，其通过高精度、高灵敏度的分析方法，能够实现对蛋白质表达水平的精准测量。

定量蛋白质组学主流方法

当前，定量蛋白质组学领域主要采用了五种主流的定量方法，分别是Label-free、iTRAQ、SILAC、MRM（包括MRMHR）和SWATH，每种方法各具特色，适用于不同的研究需求。

1. Label-free（非标记定量）

原理：Label-free技术通过直接比较不同样品中特定蛋白肽段在色谱质谱中的响应信号强度，来推断蛋白质的表达量变化。

特点：

·操作简便，无需样品标记，适合大规模蛋白鉴定和定量。

·对实验操作的稳定性和重复性要求较高，准确性略逊于标记定量方法。

·适用于大样本量定量比较及无法采用标记定量技术的实验设计。

2. iTRAQ（同位素标记相对和绝对定量）

原理：利用多种同位素试剂标记蛋白多肽的N末端或赖氨酸侧链，通过高精度质谱仪串联分析，实现多种样品间蛋白表达量的同时比较。

特点：

·可同时分析多达8种样品，高通量筛选能力强。

·定量准确，能检测出低丰度蛋白。

·适用于不同病理条件或发育阶段组织样品中蛋白质表达水平差异的研究。

3. SILAC（细胞培养条件下稳定同位素标记）

原理：在细胞培养基中加入稳定同位素标记的必需氨基酸（如赖氨酸和精氨酸），使新合成的蛋白质带上同位素标签，通过质谱分析进行相对定量。

特点：

·体内标记技术，更接近样品真实状态，标记效率高且稳定。

·适用于全细胞蛋白分析，特别是膜蛋白的鉴定和定量。

·所需蛋白样本量少，仅需几十微克。

4. MRM（多反应监测）

原理：基于已知或假定信息设定质谱检测规则，对符合规则的离子进行信号记录，去除干扰信号，实现目标蛋白的精准定量。

特点：

·高灵敏度、高重现性和高准确度，适合已知蛋白质序列的表达量差异验证。

·可检测低丰度蛋白，但单次实验检测目标蛋白数量有限（约20个）。

5. SWATH（序列窗口采集）

原理：作为MS/MS ALL技术的扩展，SWATH技术通过超高速扫描并碎裂扫描区间内所有肽段母离子，获取完整的肽段信息，实现全景式、高通量的质谱分析。

特点：

·真正的高通量、全景式质谱技术，能够提供丰富的肽段信息。

·适用于复杂样品中蛋白质的广泛鉴定和定量。

区别

TMT、LFQ和DIA是目前最常用的三种基于质谱的高通量蛋白质组学定量方法。TMT（Tandem Mass Tag，串联质量标签）方法的主要特征是在样品制备环节使用稳定同位素标记试剂与样品的酶解肽段进行反应，使待定量的肽段被标记上由多个基团组成的等质量标签，并在随后的检测中基于标签基团的信号进行多肽和蛋白的定量。

LFQ（Label Free Quantification，非标记定量）方法的主要特征是在样品制备环节无需稳定同位素标记，直接以肽段的检测信号进行肽段和蛋白的定量分析。

DIA（Data-independent Acquisition，数据非依赖性采集）方法的主要特征是其在采集质谱二级谱图时，并非基于一级谱图采集信号强度较高的肽段离子产生的二级谱图，而是根据所有离子质荷比范围划分窗口后依次采集所有肽段离子的二级谱图。由此可见，三种方法是基于其在样品制备和谱图采集层面的主要特征来命名和划分的。

图1 三种高通量蛋白质组学技术的特征差异

TMT和iTRAQ两种方法的原理和使用效果几乎一致，分别由Thermo公司和SCIEX公司开发。SCIEX公司开发的iTRAQ标记定量发布更早，但随着TMT技术标记通道的逐渐拓展和Thermo公司Obitrap系列质谱仪器在蛋白质组学市场占有率的提升，TMT技术的应用已逐渐超过和取代iTRAQ技术。

相比TMT标记定量，LFQ定量在样品制备方面步骤大大减少，因此实验周期更短，成本也更低，对于样品蛋白量的要求也更低。但同时，由于不像TMT标记定量一样可以多个样品混合后一同检测，而是每个样品分别检测，因此其数据受到质谱DDA扫描随机性的影响也更大，相比单批次的TMT标记定量，会具有更多的缺失数据和更大的定量偏差。

与LFQ和TMT相比，DIA定量技术在质谱数据采集模式和定量分析算法上有了极大的创新和优化。DIA的数据采集模式相比LFQ和TMT方法中采用的DDA数据采集模式，数据采集更完整全面，随机性更低，因此可以获得更高的定量通量和定量准确性。同时DIA和LFQ一样无需进行稳定同位素标记，因此，既保持了样品的真实度，又不会受到标记通道导致的样品数量限制。

汇总

蛋白质组学的研究，它是研究生物体内所有蛋白质的科学。里面提到了五种主要的定量方法，这些方法可以帮助科学家们更准确地测量蛋白质的数量和变化。

第一种是Label-free，就是不用给蛋白质做标记，直接比较它们在不同样品中的“信号”强弱，来知道它们的数量变化。这种方法适合大规模的蛋白质研究，但要求实验做得非常稳定和重复。

第二种是iTRAQ，它用同位素给蛋白质做标记，然后通过高精度的仪器分析，可以同时比较多种样品中蛋白质的数量。这种方法很准确，能检测到很少量的蛋白质，适合研究不同条件下蛋白质的变化。

第三种是SILAC，它是在细胞培养的时候，给细胞“喂”带有特殊标记的氨基酸，这样新合成的蛋白质就会带上这些标记。然后通过分析这些标记，就可以知道蛋白质的数量了。这种方法更接近真实的生物状态，适合全细胞蛋白质的研究。

第四种是MRM，它像是给质谱仪设定了“规则”，只关注特定的蛋白质信号，排除其他干扰，所以非常准确和灵敏。但是一次只能研究很少量的蛋白质。

最后一种是SWATH，它是一种全新的质谱技术，可以像拍照一样，一次性捕捉到样品中所有蛋白质的信息，非常全面和高通量。

总的来说，这些技术就像是科学家们的“显微镜”和“尺子”，帮助他们更深入地了解蛋白质的世界。

结论

综上所述，定量蛋白质组学技术已成为揭示生命奥秘、解析疾病机制的重要工具。Label-free、iTRAQ、SILAC、MRM和SWATH等主流方法各具优势，为研究者提供了多样化的选择。根据研究目的、样品特性及实验条件，合理选择和应用这些定量技术，将有力推动蛋白质组学研究的深入发展。

蛋白质组学平台主要设备：timsTOF Pro ，Q ExactiveHF、Q Exactive HF-X 、Orbitrap Fusion Lumos 、Orbitrap Exploris 480 ，TripleTOF 5600 plus等。质谱仪皆为高端型号，具备高分辨率、高灵敏度、高扫描速度等特性，为国内平台较高水平。