HPLC常见问题与解决方法汇总

学术   2024-12-03 16:01   上海  

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高效液相色谱是色谱法的一个重要分支。该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术鉴于HPLC在全行业运用越来越广泛,因此每一个实验室分析人员都应该熟练掌握并应用HPLC,对于一些常见的故障分析应该做到游刃有余,才能在运行故障的时候即使解决问题,提高工作效率。

 一、压 力 异 常


操作压力的变化往往是故障的征兆。从下表中找出所观察到的现象,并在右侧的列表中参考相应的解决方法。


A、没有压力显示,没有流动相流动

原 因
解决方法
1、电源问题 
1、接通电源,开机
2、保险丝被烧坏
2、更换保险丝
3、控制器设定不正确或设定失败
3、a、采取恰当的设定
   b、修理或更换控制器
4、柱塞杆折断
4、更换柱塞杆
5、泵头内有空气
5、溶剂脱气、启动泵抽出空气
6、流动相不足
6、a、补充流动相
   b、更换入口滤头
7、单向阀损坏
7、更换单向阀
8、漏液
8、拧紧或更换手紧接头

B、流动相流动正常,但没有压力显示

原 因
解决方法
1、仪表损坏
1、更换仪表
2、压力传感器损坏
2、更换压力传感器
C、压力持续偏高
原 因
解决方法
1、流速设定过高
1、调整流速设定
2、柱前筛板堵塞
2、a、在允许情况下反冲色谱柱
   b、更换筛板
   c、更换色谱柱
3、流动相使用不当或缓冲盐的结晶沉淀
3、a、使用恰当的流动相
   b、冲洗色谱柱
4、色谱柱选择不当
4、选择恰当的色谱柱
5、进样阀损坏
5、清洗或更换进样阀
6、柱温过低
6、提高温度
7、控制器失常
7、修理或更换控制器
8、保护柱阻塞
8、清洗或更换保护柱
9、在线过滤器阻塞
9、清洗或更换在线过滤器
D、压力持续偏低
原 因
解决方法
1、流速设定过低
1、调整流速
2、系统漏液
2、确定漏液位置并维修
3、色谱柱选择不当
3、选择恰当的色谱柱
4、柱温过高
4、降低温度
5、控制器失常
5、维修或更换控制器
E、压力不断上升
原 因
解决方法
1、见列表C
1、见列表C
F、压力降为零
原 因
解决方法
1、见列表A、B
1、见列表A、B
G、压力不断下降,但不回零
原 因
解决方法
1、见列表D
1、见列表D
H、压力波动
原 因
解决方法
1、泵中有气体
1、a、溶剂脱气
  b、从泵中除去气体
2、单向阀损坏
2、更换单向阀
3、泵密封损坏
3、更换泵密封
4、脱气不充分
4、a、溶剂脱气
  b、改变脱气方法(使用在线脱气法等)
5、系统漏液
5、确定漏液位置并维修
6、使用梯度洗脱
6、由于流动相粘度的变化引起的压力波动



二、漏  液



通常可以通过拧紧或更换管路接头来解决漏液的问题。但值得注意的是过分拧紧会导致金属接头的漏液和塑料接头的磨损。如果通过稍微拧紧接头不能解决漏液的问题,就必须将接头取下,检查是否损坏(例如,卡套损坏、密封表面有杂质);损坏的接头应该更换掉。


A、接头处漏液

原 因
解决方法
1、接头松动
1、拧紧
2、接头磨损
2、更换
3、接头过紧
3、a、拧松,再重新拧紧
  b、更换
4、接头被污染
4、a、拆下清洗
  b、更换
5、部件不匹配
5、使用同一品牌的配件
B、 泵漏液
原 因
解决方法
1、单向阀松动
1、a、拧紧单向阀(不必拧的过紧)
  b、更换单向阀
2、接头松动
2、拧紧接头(不必拧的过紧)
3、混合器密封损坏
3、a、更换混合器密封
  b、更换混合器
4、泵密封损坏
4、维修或更换泵密封件
5、压力传感器损坏
5、维修或更换压力传感器
6、脉冲阻尼器损坏
6、更换脉冲阻尼器
7、比例阀损坏
7、a、检查隔膜,如果漏液立即更换
  b、检查手紧接头,损坏的立即更换
8、放空阀的损坏
8、a、拧紧放空阀
  b、更换放空阀
C、进样阀漏液
原 因
解决方法
1、转子密封损坏
1、重新安装或更换进样阀
2、定量环阻塞
2、更换定量环
3、进样口密封松动
3、调整
4、进样针头尺寸不合适
4、使用恰当的进样针
5、废液管中产生虹吸
5、保持废液管高于废液液面
6、废液管阻塞
6、更换或疏通废液管

D、色谱柱漏液

原 因
解决方法
1、尾端接头松动
1、拧紧接头
2、卡套内有填料
2、拆下、清洗卡套、重新安装
3、筛板厚度不合适
3、使用合适的筛板(参考下表)
E、筛板选择指导
物质粒径
筛板孔径
3-4u
0.5u
5-20u
2u
F、检测器漏液
原 因
解决方法
1、流通池垫片损坏
1、a、避免过大的背景压力(压力降)
  b、更换垫片
2、流通池窗破碎
2、更换窗口
3、手紧接头漏液
3、拧紧或更换
4、废液管阻塞
4、更换废液管
5、流通池阻塞
5、重新安装或更换




液相色谱系统的许多问题都能在谱图上反映出来。其中有一些问题可以通过改变设备参数得到解决;而其他的问题必须通过修改操作程序来解决。对于色谱柱和流动相的正确选择是得到好的色谱图的关键。


A、峰拖尾

原 因
解决方法
1、筛板阻塞
1、a、反冲色谱柱
  b、更换进口筛板
  c、更换色谱柱
2、色谱柱塌陷
2、填充色谱柱
3、干扰峰
3、a、使用更长的色谱柱
  b、改变流动相或更换色谱柱
4、流动相PH选择错误
4、调整PH值。对于碱性化合物,低PH值更有利于得到对称峰
5、样品与填料表面的溶化点发生反应
5、a、加入离子对试剂或碱性挥发性修饰剂
 b、更改色谱柱
B、峰前延
原 因
解决方法
1、柱温低
1、升高柱温
2、样品溶剂选择不恰当
2、使用流动相作为样品溶剂
3、样品过载
3、降低样品含量
4、色谱柱损坏
4、见A1、A2
C、峰分叉
原 因
解决方法
1、 保护柱或分析柱污染

1、取下保护柱再进行分析。如果必要更换保护柱。如果分析柱阻塞,拆下来清洗。如果问题仍然存在,可能是柱子被强保留物质污染,运用适当的再生措施。如果问题仍然存在,入口可能被阻塞,更换筛板或更换色谱柱。
 2、样品溶剂不溶于流动相
2、改变样品溶剂。如果可能采取流动相作为样品溶剂。
D、峰变形
原 因
解决方法
1、样品过载
1、减少样品载量

E、早出的峰变形

原 因
解决方法
1、样品溶剂选择不恰当
1、a、减少进样体积
  b、运用低极性样品溶剂
F、早出的峰拖尾程度大于晚出的峰
原 因
解决方法
1、柱外效应
1、a、调整系统连接(使用更短、内径更小的管路)
  b、使用小体积的流通池

G、K’增加时,脱尾更严重

原 因
解决方法
1、二级保留效应,反相模式
1、a、加入三乙胺(或碱性样品)
  b、加入乙酸(或酸性样品)
  c、加入盐或缓冲剂(或离子化样品)
  d、更换一支柱子 
2、二级保留效应,正相模式
2、a、加入三乙胺(或碱性样品)
  b、加入乙酸(或酸性样品)
  c、加入水(或多官能团化合物)
  d、试用另一种方法
3、二级保留效应,离子对
3、加入三乙胺(或碱性样品)
H、酸性或碱性化合物的峰拖尾
原 因
解决方法
1、缓冲不合适
1、a、使用浓度50-100mM的缓冲液
  b、使用Pka等于流动相PH值的缓冲液
I、额外的峰
原 因
解决方法
1、样品中有其他组份
1、正常
2、前一次进样的洗脱峰
2、a、增加运行时间或梯度斜率
  b、提高流速
3、空位或鬼峰
3、a、检查流动相是否纯净
  b、使用流动相作为样品溶剂
  c、减少进样体积
J、保留时间波动
原 因
解决方法
1、温控不当
1、调好柱温
2、流动相组分变化
2、防止变化(蒸发、反应等)
3、色谱柱没有平衡
3、在每一次运行之前给予足够的时间平衡色谱柱

K、保留时间不断变化

原 因
解决方法
1、流速变化
1、重新设定流速
2、泵中有气泡
2、从泵中除去气泡
3、流动相选择不恰当
3、a、更换合适的流动相
  b、选择合适的混合流动相
L、基线漂移
原 因
解决方法
1、柱温波动。(即使是很小的温度变化都会引起基线的波动。通常影响示差检测器、电导检测器、较低灵敏度的紫外检测器或其它光电类检测器。)
1、控制好柱子和流动相的温度,在检测器之前使用热交换器。
2、流动相不均匀。(流动相条件变化引起的基线漂移大于温度导致的漂移。)
2、使用HPLC级的溶剂,高纯度的盐和添加剂。流动相在使用前进行脱气,使用中使用氦气。
3、流通池被污染或有气体
3、用甲醇或其他强极性溶剂冲洗流通池。如有需要,可以用1N的硝酸。(不要用盐酸)
4、检测器出口阻塞。(高压造成流通池窗口破裂,产生噪音基线)
4、取出阻塞物或更换管子。参考检测器手册更换流通池窗。
5、流动相配比不当或流速变化
5、更改配比或流速。为避免这个问题可定期检查流动相组成及流速。
6、柱平衡慢,特别是流动相发生变化时
6、用中等强度的溶剂进行冲洗,更改流动相时,在分析前用10-20倍体积的新流动相对柱子进行冲洗。
7、流动相污染、变质或由低品质溶剂配成
7、检查流动相的组成。使用高品质的化学试剂及HPLC级的溶剂。
8、样品中有强保留的物质(高K’值)以馒头峰样被洗脱出,从而表现出一个逐步升高的基线。
8、使用保护柱,如有必要,在进样之间或在分析过程中,定期用强溶剂冲洗柱子。
9、使用循环溶剂,但检测器未调整。
9、重新设定基线。当检测器动力学范围发生变化时,使用新的流动相。
10、检测器没有设定在最大吸收波长处。
10、将波长调整至最大吸收波长处。
M、基线噪音(规则的)
原 因
解决方法
1、在流动相、检测器或泵中有空气
1、流动相脱气。冲洗系统以除去检测器或泵中的空气。
2、漏液
2、见第三部分。检查管路接头是否松动,泵是否漏液,是否有盐析出和不正常的噪音。如有必要,更换泵密封。
3、流动相混合不完全
3、用手摇动使混合均匀或使用低粘度的溶剂
4、温度影响(柱温过高,检测器未加热)
4、减少差异或加上热交换器
5、在同一条线上有其他电子设备
5、断开LC、检测器和记录仪,检查干扰是否来自于外部,加以更正。
6、泵振动
6、在系统中加入脉冲阻尼器
N、基线噪音(不规则的)
原 因
解决方法
1、 漏液

1、见第三部分。检查接头是否松动,泵是否漏液,是否有盐析出和不正常的噪音。如有必要,更换密封。检查流通池是否漏液。
2、流动相污染、变质或由低质溶剂配成
2、检查流动相的组成。
3、流动相各溶剂不相溶
3、选择互溶的流动相
4、检测器/记录仪电子元件的问题
4、断开检测器和记录仪的电源,检查并更正。
5、系统内有气泡
5、用强极性溶液清洗系统
6、检测器内有气泡
6、清洗检测器,在检测器后面安装背景压力调节器
7、流通池污染(即使是极少的污染物也会产生噪音。)
7、用1N的硝酸(不能用磷酸)清洗流通池
8、检测器灯能量不足
8、更换灯
9、色谱柱填料流失或阻塞
9、更换色谱柱
10、流动相混合不均匀或混合器工作不正常
10、维修或更换混合器,在流动相不走梯度时,建议不使用泵的混合装置

O、宽峰

原 因
解决方法
1、流动相组成变化
1、重新制备新的流动相
2、流动相流速太低
2、调节流速
3、漏液(特别是在柱子和检测器之间)
3、见section 3。检查接头是否松动、泵是否漏液、是否有盐析出以及不正常的噪音。如果必要更换密封。
4、检测器设定不正确
4、调整设定
5、柱外效应影响
a、柱子过载
b、检测器对反应时间或池体积响应过大
c、柱子与检测器之间的管路太长或管路内径太大
d、记录仪响应时间太长
5、           
a、小体积进样(例如:10ul而不是100ul)以1:10或1:100的比例稀释样品
b、减少响应时间或使用更小的流通池
c、使用内径为0.007-0.01的短管路
d、减少响应时间
6、缓冲液浓度太低
6、增加浓度
7、保护柱污染或失效
7、更换保护柱
8、色谱柱污染或失效,塔板数较低
8、更换同样类型的色谱柱。如果新柱子可以提供对称的色谱峰,则用强溶剂冲洗旧柱子。
9、柱入口塌陷
9、打开柱入口,填补塌陷或更换柱子
10、呈现两个或多个未被完全分离的物质的峰
10、选择其它类型的色谱柱以改善分离效果
11、柱温过低
11、提高柱温。除非特殊情况,温度不宜超过75℃
12、检测器时间常数太大
12、使用较小的时间常数

P、分离度降低

原 因
解决方法
1、流动相污染或变质(引起保留时间变化)
1、重新配置流动相
2、保护柱或分析柱阻塞
2、去掉保护柱进行分析。如果必要则更换保护柱。如果分析柱阻塞,可进行反冲。如果问题仍然存在色谱柱可能被强保留的污染物损坏,建议使用恰当的再生程序。如果问题仍然存在,进口可能阻塞了,更换入口处的筛板或更换色谱柱。

Q、所有的峰面积都太小

原 因
解决方法
1、检测器衰减设定过高
1、减少衰减的设定
2、检测器时间常数设定太大
2、设定较小的时间常数
3、进样量太少
3、增大进样量
4、记录仪连接不当
4、使用正确的连接
R、所有的峰面积都太大
原 因
解决方法
1、检测器衰减设定过低
1、采取较大的衰减
2、进样过多
2、减少进样量
3、记录仪连接不正确
3、正确连接记录仪


以下问题在使用进样阀过程中有可能发生。

A、手动进样阀,转动不灵

原 因
解决方法
1、转子密封损坏
1、更换或调整转子密封
2、转子太紧
2、调整转子的松紧度
B、手动进样阀,载样困难
原 因
解决方法
1、进样阀安装不当
1、重新安装
2、定量环阻塞
2、清洗或更换定量环
3、进样器污染
3、清洗或更换进样器
4、管路阻塞
4、清洗或更换管路

C、自动进样阀,不能转动

原 因
解决方法
1、无压力(或电源)
1、提供恰当的压力(电源)
2、转子太紧
2、调整转子的松紧度
3、进样阀安装不当
3、重新安装
D、自动进样阀,其它问题
原 因
解决方法
1、阻塞
1、清洗或更换阻塞部件
2、机械故障
2、见随机维修手册
3、控制器故障
3、维修或更换控制器


由气味、景象和声音可以发现的问题,你需要运用你所有的感官去发现液相色谱的问题。你最好养成习惯,每天花上几分钟运用你的感官(除了味觉)来“感觉”你的液相色谱是否存在问题,这样可以帮助你迅速找到问题所在。例如:在你看到漏液之前,你可能首先闻到它的气味。大部分的问题是可以通过眼睛看到。

START

A、溶剂的气味

原 因
解决方法
1、漏液
1、见section 2
2、溅出
2、a、检查废液瓶是否已满
   b、找到溅出的部位并清洗干净

B、热气味

原 因
解决方法
1、仪器过热
1、a、检查并调节通风设施
   b、检查并调节温度设定
   c、关掉仪器,查找维修手册

C、读数不正常

原 因
解决方法
1、压力不正常
1、见section 2
2、柱温箱问题
2、
a、检查并调节设定
b、参照用户手册
3、检测器灯失效
3、更换灯
D、灯警告
原 因
解决方法
1、压力超出极限值
1、a、检查是否阻塞
b、检查并调节极限值的设定
2、其它警示灯
2、见用户手册

E、警告音

原 因
解决方法
1、溶剂泄漏/溅出
1、找到并解决
2、其它警告音
2、见用户手册
F、刺耳的短音或长音
原 因
解决方法
1、轴承失效
1、见用户手册
2、润滑不够
2、进行恰当的润滑
3、机械故障
3、见用户手册



常见故障及日常维护


 

下表中列出了液相色谱常见的一些问题,右侧中则列出的日常维护的方法可以减少问题出现的频率。括号中的数字是建议进行维护的时间间隔。用户手册则提供您更多的维护方法。


 

溶剂瓶
问 题
维 护
1、进口筛板阻塞
1、a、更换(3-6个月)
b、过滤流动相,0.5u滤膜
2、气泡
2、流动相脱气
问 题
维 护
1、气泡
1、流动相脱气
2、泵密封损坏
2、更换(3个月)
3、单向阀损坏
3、过滤流动相,运用在线过滤,准备备用单向阀
进样阀
问 题
维 护
1、转子密封损坏
1、a、不要拧的过紧
b、过滤样品
色谱柱 
问 题
维 护
1、筛板阻塞
1、a、过滤流动相
  b、过滤样品
  c、运用在线过滤或保护柱
2、柱头塌陷
2、a、避免使用PH>8的流动相(针对大部分硅胶的柱子)
  b、使用保护柱
  c、使用预柱(饱和色谱柱)
检测器
问 题
维 护
1、灯失效,检测器响应降低,噪音增大
1、更换(6个月)或准备备用灯
2、流通池有气泡
2、a、保持流通池清洁
  b、池后使用反压抑制器
  c、流动相脱气
一般
问 题
维 护
1、腐蚀/摩擦损坏
1、在不使用时保持系统缓冲液的清洁



END


来源|Analyse学堂

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